Un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre

La quimiotaxis, un proceso de migración celular dirigida a un gradiente de concentración química soluble, está implicada de manera crítica en muchos procesos biológicos incluyendo la respuesta inmune ^{1 , 2 , 3} , el desarrollo de tejido ⁴ y la metástasis de cáncer ⁵ . Los neutrófilos son el subconjunto de glóbulos blancos más abundantes y desempeñan un papel crucial en la habilitación de las funciones innatas de defensa del huésped del cuerpo, así como en la mediación de las respuestas inmunes adaptativas ^{6 , 7} . Los neutrófilos están equipados con maquinaria quimiotáctica altamente regulada que permite a estas células inmunitarias móviles responder tanto a los quimioatrayentes derivados de patógenos ( por ejemplo, fMLP) como a los quimioatractores derivados del huésped ( por ejemplo, interleucina-8) a través ^{de la} quimiotaxis ⁸ . La migración de neutrófilos y la quimiotaxis median diversos problemas fisiológicosY enfermedades tales como inflamación y cánceres ^{1 , 9} . Por lo tanto, la evaluación precisa de la quimiotaxis de neutrófilos proporciona una lectura funcional importante para el estudio de la biología de neutrófilos y las enfermedades asociadas.

En comparación con los ensayos de quimiotaxis convencional ampliamente utilizados ( por ejemplo, el ensayo de transwell ¹⁰ ), los dispositivos microfluídicos son muy prometedores para la evaluación cuantitativa de la migración celular y la quimiotaxis debido a la generación de gradiente químico controlado con precisión y la miniaturización ^{11 , 12 , 13} . Durante las dos últimas décadas aproximadamente, se han desarrollado varios dispositivos microfluídicos para estudiar la quimiotaxis de diferentes tipos de células biológicas, especialmente los neutrófilos ¹¹ . Se realizó un esfuerzo significativo para caracterizar la migración de neutrófilos Micos que se configuraron en los dispositivos microfluídicos ^{14 , 15} . También se desarrollaron estrategias interesantes para estudiar la toma direccional de decisiones por parte de los neutrófilos utilizando los dispositivos microfluídicos. ^{16 Al} margen de la investigación biológicamente orientada, las aplicaciones de los dispositivos microfluídicos se han ampliado para probar las muestras clínicas para la evaluación de la enfermedad 17,18,19. Sin embargo, el uso de muchos dispositivos microfluídicos se limita a laboratorios de investigación especializados y requiere un largo aislamiento de neutrófilos de un gran volumen de muestras de sangre. Por lo tanto, ha habido una tendencia creciente del desarrollo de dispositivos microfluídicos integrados para el análisis rápido de quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre entera ^{20 , 21 , 22 ,}Ef "> 23 ^{, 24} .

Hacia esta dirección, se desarrolló un método de todo en chip que integra la purificación de neutrófilos negativos magnéticos y el subsiguiente ensayo de quimiotaxis en un solo dispositivo microfluídico ²⁵ . Este método todo-en-chip tiene las siguientes características novedosas: 1) en contraste con las estrategias de chip anteriores que aíslan neutrófilos de la sangre mediante la captura de células basadas en adhesión o el filtrado basado en tamaño de celda ^{20 , 22} , Pureza, separación magnética sobre chip de los neutrófilos de pequeños volúmenes de sangre completa, así como medición de quimiotaxis mediante estimulación quimioatrayente; 2) la estructura de acoplamiento de células ayuda a alinear las posiciones iniciales de los neutrófilos cerca del canal de gradiente químico y permite un análisis de quimiotaxis simple sin rastreo de células individuales; 3) la integración del aislamiento de neutrófilos y chemotEje en un único dispositivo microfluídico permite un análisis rápido de la quimiotaxis de muestra a resultado en 25 minutos cuando no hay interrupción entre los pasos experimentales.

Este documento proporciona un protocolo detallado para la construcción, operación y análisis de datos método de este todo-en-chip quimiotaxis ensayo. El artículo demuestra el uso efectivo del método desarrollado para realizar la quimiotaxis de neutrófilos mediante la prueba de un quimioatrayente recombinante conocido y muestras quimiotácticas complejas de pacientes, seguido por una discusión sobre estrategias de resolución de problemas, limitaciones y direcciones futuras.