Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue

A quimiotaxia, um processo de migração de células direcionadas para gradiente de concentração química solúvel, é criticamente envolvida em muitos processos biológicos, incluindo resposta imune ^{1 , 2 , 3} , desenvolvimento de tecido ⁴ e metástase de câncer ⁵ . Os neutrófilos são o subconjunto mais abundante de glóbulos brancos e desempenham papéis cruciais na habilitação das funções de defesa do hospedeiro inatas do corpo, bem como na mediação das respostas imunes adaptativas ^{6 , 7} . Os neutrófilos estão equipados com maquinaria quimiotáctica altamente regulada, permitindo que essas células imunes móveis respondam tanto a quimiotratantes derivados de patógenos ( por exemplo, fMLP) como a quimiotractivos derivados do hospedeiro ( por exemplo, interleucina-8) através ^de quimioestamento ⁸ . A migração de neutrófilos e a quimiotaxia medem vários problemas fisiológicosE doenças como inflamação e câncer ^{1 , 9} . Assim, a avaliação precisa da quimiotaxia dos neutrófilos fornece uma leitura funcional importante para estudar a biologia dos neutrófilos e as doenças associadas.

Em comparação com os ensaios de quimiotexia convencional amplamente utilizados ( por exemplo, o ensaio Transwell ¹⁰ ), os dispositivos microfluídicos são de grande promessa para a avaliação quantitativa da migração celular e da quimiotaxia devido à geração de gradiente químico e miniaturização com precisão ^{11 , 12 , 13} . Nas últimas duas décadas, vários dispositivos microfluídicos foram desenvolvidos para estudar a quimiotaxia de diferentes tipos de células biológicas, especialmente neutrófilos ¹¹ . Um esforço significativo foi dedicado a caracterizar a migração de neutrófilos no complexo spatiotemporalmente complexo. Gradientes micos que foram configurados nos dispositivos microfluidicos ^{14 , 15} . Estratégias interessantes também foram desenvolvidas para estudar a tomada de decisão direcional por neutrófilos usando os dispositivos microfluídicos ^16. A partir de pesquisas orientadas biologicamente, as aplicações de dispositivos microfluídicos foram estendidas para testar amostras clínicas para avaliação de doenças ^{17 , 18 , 19} . No entanto, o uso de muitos dispositivos microfluídicos é limitado a laboratórios especializados de pesquisa e exige um isolamento prolongado de neutrófilos a partir de grandes quantidades de amostras de sangue. Portanto, tem havido uma tendência crescente de desenvolvimento de dispositivos microfluídicos integrados para análise rápida de quimiotaxia de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue total ^{20 , 21 , 22 ,}Ef "> 23 ^{, 24} .

Em direção a esta direção, desenvolveu-se um método todo-on-chip que integra a purificação de neutrófilos negativos magnéticos eo subsequente teste de quimiotaxia em um único dispositivo microfluídico ²⁵ . Este método tudo-em-chip tem os seguintes recursos inovadores: 1) em contraste com as estratégias anteriores sobre o chip que isolam os neutrófilos do sangue por captura de células à base de adesão ou filtragem baseada em tamanho celular ^{20 , 22} , este novo método permite alta Pureza, separação magnética no chip dos neutrófilos de pequenos volumes de sangue total, bem como medição de quimiotaxia na estimulação quimiotratante; 2) a estrutura de encaixe da célula ajuda a alinhar as posições iniciais dos neutrófilos perto do canal de gradiente químico e permite análise de quimiotexia simples sem rastreamento celular único; 3) a integração do isolamento de neutrófilos e quimioterapiaO ensaio de eixo em um único dispositivo microfluídico permite uma rápida análise de quimiotaxia de amostra a resultado em 25 min quando não há interrupção entre etapas experimentais.

Este artigo fornece um protocolo detalhado para o método de construção, operação e análise de dados deste ensaio de quimiotaxia todo-em-chip. O documento demonstra o uso efetivo do método desenvolvido para realizar a quimiotaxia de neutrófilos, testando amostras chemoatractantes recombinantes recombinantes conhecidas e amostras chemotacticas complexas de pacientes, seguidas de uma discussão sobre estratégias de solução de problemas, limitações e direções futuras.