La misurazione della legame proteico con F-actina mediante co-sedimentazione

1. Preparare i Materiali Purificare la proteina di interesse (vedere la sezione 2). Preparare o acquistare G-actin. NOTA: l'actina G può essere isolata da più sorgenti 1 ; In alternativa, può essere acquistato. L'agente G-ricostituito (in 5 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM ATP (adenosina trifosfato) e 0,5 mM dithiothreitolo (DTT)) deve essere congelato, conservato a -80 ° C e> 10 mg / ml In piccole aliquote (10-20 μL) e scongelate poco prima dell'uso. Le aliquote di G-actin non devono essere ricondizionate. Preparare o acquistare una proteina di controllo, come la BSA (vedere la fase 4.4). Preparare il tampone di polimerizzazione 10 volte (200 mM imidazolo pH 7,0, 1 M KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP e 10 mM EGTA (etilene glicol-bis (β-aminoetil etere) -N, N, N ', N'- Acido tetraacetico)). Effettuare una azione di 10x e regolare il pH dopo l'aggiunta di ATP, se necessario. Aliquota (25 μL è un volume utile) e memorizzare a -80 & #176; C. Preparare tampone di reazione 10x (200 mM imidazolo pH 7,0, 1,5 M NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP e 10 mM EGTA). Effettuare una azione di 10x e regolare il pH dopo l'aggiunta di ATP, se necessario. L'aliquota (50-100 μL è un volume utile) e conservare a -80 ° C. NOTA: La composizione del tampone di reazione è flessibile e può essere necessario regolare per ridurre la sedimentazione in background, limitare il legame non specifico e / o migliorare il legame (punti 1.5.1-1.5.3). Regolare il pH del tampone di reazione tra 6 e 8 per ottimizzare la stabilità proteica. Ad un pH inferiore o superiore, sostituire un appropriato tampone per l'imidazolo. NOTA: Utilizzare pH 7,0 come punto di partenza, a meno che una proteina non richieda un pH più basso o superiore per la stabilità. Non utilizzare un buffer con un pH inferiore a 6,0 o superiore a 8,0, in quanto ciò potrebbe interrompere l'actina. I buffer consigliati (concentrazione finale e pH ottimale elencati) includono: 20 mM MOPS (3- ( N- morfolino) acido propansolfonico), pH= 6,5; 20 mM imidazolo, pH = 7,0; 10 mM HEPES (acido 4- (2-idrossietil) piperazina-1-etansolfonico), pH = 7,5; E 20 mM Tris, pH = 8,0. Variare la concentrazione di sale del tampone di reazione, a seconda delle esigenze del saggio. NOTA: Actin è una proteina acida, e quasi tutte le proteine ​​legate all'attinito si basano in una certa misura sulle interazioni elettrostatiche da associare con l'actina. Pertanto, aumentando la concentrazione salina diminuisce l'attin binding nella maggior parte dei casi. Il tampone di reazione utilizza un livello fisiologico di sale (150 mM NaCl, concentrazione di lavoro) e questo è il punto di partenza consigliato. Se necessario, la concentrazione di sale può essere abbassata ( ad esempio, a 100 mM) per promuovere il legame o aumentare per limitare il legame. Non modificare le concentrazioni di MgCl2, ATP o EGTA nel reattore di reazione, a meno che non vi sia ragione specifica per farlo. 2. Preparare la proteina di prova per il dosaggio preparEa proteina ad alta purezza utilizzando cromatografia liquida per i migliori risultati 7 . NOTA: Se si utilizzano proteine ​​ricombinanti, tagli taglienti di grandi dimensioni, come la glutatione-S-transferasi (GST), devono essere rimossi dalla proteasi di scissione dalla proteina bersaglio, in quanto possono interferire con il legame. GST provoca anche l'omodimerizzazione delle proteine ​​di fusione, che possono aumentare artificialmente l'affinità dell'attacco di actina. Determinare la concentrazione proteica misurando l'assorbanza a 280 nm. Divide per il coefficiente di estinzione; Il coefficiente di estinzione può essere calcolato dalla sequenza proteica usando analisi di sequenza o strumenti online. In alternativa, determinare la concentrazione proteica usando metodi Bradford o BCA (acido bicinchonico). NOTA: Per esperimenti iniziali, di solito è sufficiente 50-100 μL di proteine ​​a 20-40 μM. Ciò consentirà l'analisi del legame nella bassa gamma micromolare, un utile punto di partenza per la maggior parte delle proteine ​​legate all'attina. Un numero maggioreE spesso una maggiore concentrazione di proteine ​​è necessaria per generare una curva di legame per calcolare l'affinità (vedere la sezione 5). Poco prima dell'uso, spin la proteina (50.000-100.000 xg per 10 minuti a 4 ° C) per rimuovere gli aggregati di proteine ​​insolubili. Se la solubilità è una preoccupazione, riesaminare la concentrazione proteica (fase 2.2) dopo la centrifugazione. 3. Preparare l'F-actin Rimuovere una aliquota di G-actina dal congelatore -80 ° C e scongelarla rapidamente. Aggiungere il tampone di polimerizzazione 10 volte all'attin-G fino ad una concentrazione finale di 1x. Assicurarsi che la concentrazione di actina G in 1x buffer di polimerizzazione sia almeno 10-20 μM, ben al di sopra della concentrazione critica. Incubare per 1 h a temperatura ambiente (RT) per consentire l'actina a polimerizzare. Dopo la polimerizzazione, conservare l'F-actina in soluzione a 4 ° C, dove sarà stabile per alcune settimane. Prima di utilizzare nuovamente l'Actin F dopo l'immagazzinamento, invertite delicatamenteO girare il tubo più volte per assicurare che tutta l'actina sia sciolta e distribuita uniformemente in soluzione. NOTA: (Facoltativo) Aggiungere phalloidin per ottenere un rapporto molare 1: 1 di actin-G: phalloidin. Incubare per 30 minuti a RT per permettere al falloidino di legarsi all'actin F. Il falloidina stabilizza F-actina e compie due cose: (i) riduce la quantità di actina che non si sedimenta durante la centrifugazione e (ii) permette di diluire F-actina al di sotto della concentrazione critica (~ 0,5 μM) Necessario per variare la quantità di F-actin per generare una curva di legame (vedere la sezione 5 sulla misura dell'affinità). 4. Analisi di pellicola – protocollo di base NOTA: Il protocollo di base descritto nella sezione 4 viene utilizzato per determinare se una proteina di interesse co-sedimenti con F-actina. Una volta stabilito il legame con F-actina, l'affinità di questa interazione può essere misurata seguendo il protocollo descritto nella sezione 5. Preparare il buffer di reazione il giorno di utilizzo diluendo lo stock 10x a 1x e aggiungere DTT ad una concentrazione finale di 1 mM. NOTA: (Facoltativo) Aggiungere il polidocanolo ad una concentrazione di lavoro finale del 0,02% nel tampone di reazione. Polidocanol è un tensioattivo che riduce il legame non specifico di sfondo e aiuta a prevenire le proteine ​​idrofobiche da attaccarsi al tubo ultracentrifugo. Diluire la proteina di interesse alle concentrazioni desiderate in tampone di reazione 1x in tubi di ultracentrifuga. Mantenere i volumi di campione bassi (40-60 μL) per evitare di utilizzare grandi quantità di proteine ​​usando tubi di ultracentrifuga con piccoli volumi minimi ( ad es . Tubi da 7 x 20 mm che detengono 0,2 mL ciascuno). NOTA: poiché molte proteine ​​legate all'attinità hanno un'affinità per F-actina nell'intervallo micromolare, è consigliabile testare una proteina di interesse a 2 e 10 μM. Se il legame non è osservato a 10 μM, è improbabile che la legame verrà osservata a concentrazioni più elevate. Se laLa proteina aggiunta compone più del 10-20% del volume di reazione finale, può essere necessario dializzare la proteina nel tampone di reazione prima di eseguire l'esperimento. Aggiungere F-actina alla concentrazione finale desiderata. NOTA: 2 μM è una concentrazione utile per gli esperimenti iniziali perché è ben al di sopra della concentrazione critica, mantenendo così l'actina nello stato filamentoso. Essa produrrà un pellet visibile quando analizzato con SDS-PAGE (punto 4.10). Preparare i seguenti controlli nei tubi di ultracentrifuga per rendere informativo il dosaggio. Preparare campioni contenenti la proteina di interesse senza F-actina. Assicurarsi che la concentrazione di proteine ​​in questi campioni corrisponda alla concentrazione nei campioni "plus F-actin". NOTA: Questi campioni determineranno la quantità di proteine ​​aggregata o attaccata ai lati del tubo ultracentrifugo in assenza di F-actina. Preparare campioni di controllo negativiAlla stessa o simile concentrazione utilizzata per la proteina di interesse. Utilizzare una proteina di controllo che non lega F-actina, con e senza F-actina. NOTA: Questo è un controllo importante perché le proteine ​​possono diventare "intrappolate" nei filamenti di actina e nel pellet con F-actina, anche se non legano F-actina. La quantità di cattura può variare a seconda dell'origeno F-actin, delle condizioni del buffer, ecc. Quindi questo controllo dovrebbe essere incluso in tutti gli esperimenti. Idealmente, la proteina di controllo dovrebbe avere un peso molecolare simile alla proteina di interesse ( ad esempio per αE-catenina (~ 100 kDa), BSA (66 kDa) è un controllo appropriato). Gli standard di filtrazione gel disponibili in commercio offrono eccellenti proteine ​​di controllo, in quanto coprono una gamma di dimensioni e tendono a non contenere aggregati. Facoltativamente, preparare campioni di controllo positivi contenenti una proteina che si lega alla F-actina, con e senza F-actina. Assicurarsi che le concentrazioni siano simili a quelle della thE proteina di interesse. NOTA: Questo controllo è utile in quanto dimostra che le condizioni sperimentali ( ad esempio preparato F-actina, tampone di reazione e centrifugazione) consentono di legare F-actina. Poiché il test di pelleting non riesce a rilevare interazioni deboli di F-actina (si veda la discussione), si raccomanda che la nota proteina legante F-actina abbia una affinità moderata-debole per l'actina F ( cioè nel basso range micromolare ). Le proteine ​​leganti di F-actina purificate sono commercialmente disponibili. Incubare tutti i campioni per 30 minuti a RT. NOTA: I tempi di incubazione più lunghi sono soddisfacenti, assumendo che la proteina di interesse sia stabile, anche se probabilmente non necessaria. Se la proteina di interesse non è stabile a RT, allora i campioni possono essere incubati a 4 ° C. In questo caso, potrebbero essere necessari tempi di incubazione più lunghi. Caricare i campioni nel rotore di centrifuga. Posizionare i tubi all'interno del rotore per aiutare a risospendere il pellet dopo la centrifugazione.Per questo, contrassegnare tutti i tubi centrifughi ( ad es. Con un numero di campione) e posizionare tutti i tubi nel rotore nella stessa posizione ( ad esempio, il numero rivolto verso l'esterno). Centrifugare a 100.000 xg per 20 minuti a 4 ° C in un ultracentrifugo. Dopo centrifugazione, rimuovere 3/4 del surnatante ( ad es . 45 μL se il volume di partenza è di 60 μL) da ogni tubo e mescolare con 1/3 volumi di tampone di campione 4x (15 μL in questo caso) in un tubo di microcentrifuga separato. Rimuovere il residuo supernatante con una punta di carico del gel, facendo attenzione a non disturbare il pellet (che può essere visibile come un punto vetroso). NOTA: È importante rimuovere il surnatante dai tubi appena possibile dopo la conclusione della centrifuga per limitare la separazione della proteina dalla dissociazione. Inoltre, non lavare il pellet con buffer di reazione per lo stesso motivo. Aggiungere 4/3 volumi di 1x campione di tampone per ogni pelleT ( ad esempio , 80 μL se il volume di partenza era di 60 μL). NOTA: Ciò rende la diluizione uguale a quella del supernatante (fase 4.8, 1/3 volumi di tampone campione 4x sono stati aggiunti), consentendo il confronto diretto tra campioni di pellet e supernatante e la determinazione della percentuale di proteine ​​che è stata pelletata. Aggiungere il campione di tampone a tutti i tubi e incubare per almeno 5 minuti a RT. Lasciare che il pellet si posiziona nel tampone campione per migliorare il recupero del campione. Tritare il campione 8-10 volte con una punta pipetta p200 per riassorbire il pellet lavando continuamente l'area pellet del tubo. Raschiare delicatamente la punta della pipetta sopra il pellet durante la triturazione per aiutare con la resuspensione. NOTA: Fare attenzione a non introdurre aria nel campione durante la triturazione, in quanto ciò provocherà il buffer di campionamento a bolle e ridurrà il recupero del campione. Trasferire i campioni riposizionati in tubi microfughi dopo triturazione. </ Ol> Analizzare i campioni di supernatante e pellet con la colorazione SDS-PAGE e Coomassie 8 caricando 10-15 μL di campione per corsia; Questo è sufficiente per visualizzare le proteine. NOTA: Le proteine ​​che co-sedimentare con F-actin saranno arricchite nei campioni di pellet "plus F-actin" sui campioni di pellet "no F-actin" ( Figura 1A ). La colorazione blu di Coomassie standard è sufficiente per rilevare se le concentrazioni di proteine ​​sono nella gamma di 0,1-10 μM. Coomassie Colloidal 9 o Western blotting possono essere utilizzati per aumentare la sensibilità se si utilizzano basse concentrazioni proteiche per misurare interazioni di affinità più elevate. Immagine Gel gelati con Coomassie utilizzando un sistema di scansione o di imaging (fase 5.12). 5. Analisi della pellicola – Quantificazione Nota: se si osserva un legame specifico con F-actina, può essere utile misurare l'affinità di tInterazione. Ciò si ottiene facendo alcune modifiche e aggiunte al protocollo delineato nella sezione 4. Per un'eccellente guida per la progettazione e l'interpretazione dei test di associazione, vedere Pollard 10 . Viene fornito un diagramma di flusso ( figura 2 ) per l'assistenza con l'analisi e la quantificazione. Determinare il range di concentrazione da testare. NOTA: L'intervallo di concentrazione dipenderà dalla proteina e dovrebbe spingere da una concentrazione inferiore all'apparente K d ( ad esempio, 1 μM) a concentrazioni sufficientemente elevate da saturare il legame. È fondamentale che il legame raggiunga la saturazione in campioni multipli all'estremità superiore della gamma di concentrazione per generare una curva di legame accurata ( figura 1C ). Come sopra osservato, molte proteine ​​legate all'attinità hanno un'affinità per l'F-actina nel basso intervallo micromolare (1-5 μM). Per una proteina con K d di 0,5-1 μM, un utile intervallo di concentrazione iniziale sarebbe di 0,1-10 μM. Spin duro (passo 2.3) la proteina di interesse per rimuovere gli aggregati. Diluire serialmente la proteina per produrre una serie di concentrazioni contenenti 7-8 campioni a 2x la concentrazione finale da testare. Ad esempio, se la gamma da test è di 0,1-8 μM, preparare le seguenti diluizioni in tampone di reazione 1x: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,2 μM. NOTA: Come indicato nel punto 4.2, se la proteina aggiunta compone più del 10% -20% della prima diluizione (il campione di 16 μM nell'esempio precedente), può essere necessario concentrare ulteriormente la proteina o dializzare Proteina in tampone di reazione 1x. Assicurati di preparare abbastanza per ogni diluizione per i campioni "più F-actin" e "no F-actin". Preparare i campioni (come nella sezione 4), diluendo la proteina di interesse alle concentrazioni desiderate in tampone di reazione 1x in tubi di ultracentrifuga. Mantenere i volumi di campione bassi (40-60 μL) per evitare l'utilizzo di grandi quantità di proteine ​​utilizzando ultracentTubi di scarico con piccoli volumi minimi ( ad es. , Tubi da 7 x 20 mm che detengono 0,2 ml ciascuno). Aggiungere F-actina alla concentrazione finale desiderata ai campioni appropriati e riportare il volume utilizzando un tampone di reazione 1x. Ad esempio, per le reazioni di 50 μl usando 2 μM di F-actina, assicurarsi che ogni campione disponga di 25 μL di 2x proteine, 10 μL di 10 μM di F-actina e di 15 μL di tampone di reazione 1x. Includere campioni di controllo (passaggi 4.4.2 e 4.4.3). NOTA: per i controlli negativi e positivi, usare una concentrazione all'interno della gamma da sottoporre a prova (punto 5.1), idealmente vicino al centro fino alla fascia alta dell'intervallo ( ad es. 4 μM se la gamma di concentrazione è di 0,1-10 μM). Incubare tutti i campioni per 30 minuti a RT. Dopo 30 minuti, rimuovere 1/5 di ogni campione ( ad es. 10 μL della reazione di 50 μl) e mescolare con 20 μL di acqua e 10 μL di campione 4 volte. NOTA: Questi sono i "Totale"Amples e verrà utilizzato per generare una curva standard. Caricare i campioni nel rotore ultracentrifugo. Centrifugare per 20 minuti a 100.000 xg e 4 ° C. Ad ogni modo, dopo centrifugazione, rimuovere 3/4 del surnatante ( ad es. 30 μL se il volume centrifugato è di 40 μL) da ogni tubo e mescolare con un tampone di campione 4 volte (10 μL in questo caso) in un tubo di microfuga separato. Rimuovere il rimanente supernatante con una punta di carico del gel, facendo attenzione a non disturbare il pellet. NOTA: quando si misura l'affinità di binding, non è necessario eseguire il surnatante. Tuttavia, può essere utile salvare il surnatante, specialmente quando si prova una nuova proteina. Rimuovere il supernatante se non analizzando (punto 5.7). Resuspendere il pellet in 1 volume di tampone 1x campione ( es. 40 μL se il volume centrifugato è di 40 μL). Aggiungere il campione di tampone a tutti i tubi e incubare per almeno 5 minuti a RT. TrItare il campione 8-10 volte con una punta pipetta p200, lavando continuamente l'area pellet del tubo. Raschiare delicatamente la punta della pipetta sopra il pellet durante la triturazione per aiutare con la resuspensione. Trasferire la proteina risospesa in un tubo di microcentrifuga. NOTA: Questi sono i campioni "Pellet". Analizzare i campioni di Total e Pellet da SDS-PAGE 8 . Eseguire tutti i campioni su un solo gel, se possibile; Se no, eseguire i campioni di pellet su un solo gel e i campioni totali su un secondo. NOTA: Tenuto conto del numero di campioni, è consigliato un grande sistema di gel per l'analisi. Se si esegue campioni su due o più gel, è importante che tutti i gel siano macchiati in modo identico ( cioè la stessa soluzione Coomassie e un'ora identica in macchia / destain). Immagine Gel gelati con Coomassie usando un sistema di imaging che misura le intensità della banda proteica su una vasta gamma ( cioè da due a tre log) e lineare. Assicurarsi che le immagini aVengono raccolti senza pixel saturi. NOTA: i sistemi di imaging a laser offrono i migliori rapporti di sensibilità e segnale / rumore. Utilizzando ImageJ o un programma di analisi simile, misurare le intensità della banda proteica e calcolare la quantità di proteine ​​legate. NOTA: Per tutte le misurazioni del campione, utilizzare lo strumento di selezione in ImageJ per disegnare una regione di interesse (ROI) attorno a ciascuna banda e misurare (Analizza> Misura) l'area e il valore medio grigio. Calcolare lo sfondo di ciascun gel misurando il valore medio grigio da un'area senza campione. Sottrai il valore medio grigio medio di sfondo da ogni valore grigio medio ROI e poi moltiplica per l'area per ottenere il valore integrato di densità per ciascuna banda. Misurare la proteina di intensità di banda di interesse dai campioni totali ( Figura 2A ). Genera una curva standard plottando l'intensità della banda ( cioè le misurazioni integrate di densità) rispetto alla massa proteica ( Figura2B). Misurare la quantità di proteine ​​di interesse che sono co-sedimentate con F-actina (proteina co-sedimentata, figura 2C ). Misurare la quantità di proteine ​​di interesse che si sono sedimentate in assenza di F-actin (sedimentazione di sfondo, figura 2D ). Sottrai la sedimentazione di sfondo dalla proteina co-sedimentata ( vale a dire sottrarre i valori dalla fase 5.13.4 dal punto 5.13.3) per determinare la quantità di proteina legata all'actin F. Misurare la quantità di F-actina in ogni pellet ( Figura 2E ). Determinare la quantità media di F-actina per campione e quindi dividere ogni campione in media per determinare il rapporto di F-actina in ogni campione rispetto alla media ( cioè i numeri sotto i bande). Per ciascun campione, dividere la quantità di proteina legata (calcolata nel punto 5.13.5) dal rapporto pellet actin F-actin (fase 5.13.6) per regolare le differenze nel pellet. NOTE: Questo valore è la proteina legata normalizzata. Utilizzare la curva standard (punto 5.13.2) per calcolare la quantità (massa) della proteina legata normalizzata (punto 5.13.7) in ciascun campione. NOTA: La proteina inizialmente rimossa (il campione "Totale") e la quantità caricata (che, a meno che non venga caricato l'intero pellet, sarà una frazione del pellet), deve essere calcolato nel calcolo della quantità totale di proteine Che pelletato. Determinare la concentrazione di proteine ​​legate in ciascun campione dalla massa totale di proteine ​​nel pellet (calcolata nel punto 5.13.8) e il volume del campione. Sottrai questo valore dalla concentrazione di partenza per determinare la quantità di proteina libera. Dividere la concentrazione della proteina legata dalla concentrazione di actina (μM / μM di actina) e dalla trama rispetto alla concentrazione della proteina libera per generare una curva di legame ( Figura 1C ). NOTA: Poiché F-actin non è una specie singola, uniforme, è difficileCulto per estrapolare la concentrazione molare di F-actina dalla concentrazione di actina G. Utilizzare la concentrazione iniziale di G-actina per determinare la quantità di proteina legata (μM / μM di actina) e stimare la concentrazione apparente dei siti di legame nella reazione. La concentrazione di siti di legame è di solito inferiore alla concentrazione di monomeri di actina nella reazione perché non tutta l'actina polimerizza e perché una singola molecola proteina legante dell'attina può mettere in contatto con monomeri multipli sul filamento di actina. Utilizzando un programma statistico, determinare l'affinità (K d ) e B max dalla curva di binding utilizzando la regressione non lineare di minimi quadrati. NOTA: i diagrammi di Scatchard sono scoraggiati per analizzare i dati legati, in parte perché possono oscurare se il legame è saturo e perché possono distorcere l'errore sperimentale 10 .