Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação

1. Preparar os Materiais Purificar a proteína de interesse (ver secção 2). Prepare ou compre G-actina. NOTA: A G-actina pode ser isolada a partir de múltiplas fontes 1 ; Alternativamente, ele pode ser comprado. A G-actina reconstituída (em Tris 5 mM, pH 8,0, CaCl2 0,2 ​​mM, ATP 0,2 mM (adenosina trifosfato) e ditiotreitol 0,5 mM (DTT)) deve ser congelada instantaneamente, armazenada a -80 ° C e> 10 mg / mL Em alíquotas pequenas (10-20 μL) e descongeladas imediatamente antes do uso. As alíquotas de G-actina não devem ser recongeladas. Prepare ou adquira uma proteína de controlo, tal como BSA (ver passo 4.4). Preparar tampão de polimerização 10x (imidazol 200 mM pH 7,0, KCl 1 M, MgCl2 20 mM, ATP 5 mM e EGTA 10 mM (éter de etileno glicol bis (p-aminoetil) -N, N, N ', N'- Tetraacético)). Faça um estoque 10x e ajuste o pH após a adição de ATP, se necessário. Alíquota (25 μL é um volume útil) e armazenar a -80 & #176; C. Preparar 10x tampão de reacção (imidazol 200 mM pH 7,0, NaCl 1,5 M, MgCl2 20 mM, ATP 5 mM e EGTA 10 mM). Faça um estoque 10x e ajuste o pH após a adição de ATP, se necessário. Alíquota (50-100 μL é um volume útil) e armazenar a -80 ° C. NOTA: A composição do tampão de reacção é flexível e pode necessitar de ser ajustada para reduzir a sedimentação de fundo, limitar a ligação não específica e / ou melhorar a ligação (passos 1.5.1-1.5.3). Ajustar o pH do tampão de reacção entre 6 e 8 para optimizar a estabilidade da proteína. A um pH mais baixo ou mais elevado, substitua o imidazole por um tampão apropriado. NOTA: Utilize pH 7,0 como ponto de partida, a menos que uma proteína necessite de um pH inferior ou superior para a estabilidade. Não utilize um tampão com um pH inferior a 6,0 ou superior a 8,0, uma vez que isto pode perturbar a actina. Os tampões recomendados (concentração final e pH óptimo listados) incluem: MOPS 20 mM (ácido 3- ( N- morfolino) propanossulfónico), pH= 6,5; Imidazole 20 mM, pH = 7,0; HEPES 10 mM (ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico), pH = 7,5; E Tris 20 mM, pH = 8,0. Variar a concentração de sal do tampão de reacção, dependendo das necessidades do ensaio. NOTA: A actina é uma proteína ácida, e quase todas as proteínas de ligação à actina dependem, em certa medida, de interacções electrostáticas para associar-se à actina. Consequentemente, o aumento da concentração de sal diminui a ligação da actina na maioria dos casos. O tampão de reacção utiliza um nível fisiológico de sal (NaCl 150 mM, concentração de trabalho), e este é o ponto de partida recomendado. Se necessário, a concentração de sal pode ser reduzida ( por exemplo, até 100 mM) para promover a ligação ou aumentada para limitar a ligação. Não altere as concentrações de MgCl 2 , ATP ou EGTA no tampão de reacção, a menos que haja uma razão específica para o fazer. 2. Preparar a Proteína de Teste para o Ensaio PrepararEa proteína de alta pureza usando cromatografia líquida para obter os melhores resultados 7 . NOTA: Se estiver a utilizar proteína recombinante, devem ser removidas proteínas de proteínas grandes, tais como a glutationa-S-transferase (GST) por clivagem de protease da proteína alvo, uma vez que podem interferir com a ligação. O GST também causa a homodimerização de proteínas de fusão, que podem aumentar artificialmente a afinidade da ligação da actina. Determine a concentração de proteína medindo a absorbância a 280 nm. Divida pelo coeficiente de extinção; O coeficiente de extinção pode ser calculado a partir da sequência de proteínas utilizando a análise de sequências ou ferramentas on-line. Alternativamente, determinar a concentração de proteína usando Bradford ou BCA (ácido bicinchoninic) métodos. NOTA: Para as experiências iniciais, 50-100 μL de proteína a 20-40 μM é normalmente suficiente. Isto permitirá a análise da ligação na gama micromolar baixa, um ponto de partida útil para a maioria das proteínas de ligação à actina. Um quan maiorE muitas vezes uma maior concentração de proteína são necessários para gerar uma curva de ligação para calcular a afinidade (ver secção 5). Imediatamente antes do uso, centrifugação dura da proteína (50.000-100.000 xg durante 10 min a 4 ° C) para remover os agregados de proteína insolúvel. Se a solubilidade for uma preocupação, re-medir a concentração de proteína (passo 2.2) após a centrifugação. 3. Prepare a F-actina Remova uma alíquota de G-actina do congelador de -80 ° C e descongelá-lo rapidamente. Adicionar o tampão de polimerização 10x à G-actina até uma concentração final de 1x. Assegurar que a concentração de G-actina no tampão de polimerização 1x é pelo menos 10-20 μM, bem acima da concentração crítica. Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente (RT) para permitir que a actina polimerize. Após a polimerização, armazenar a F-actina em solução a 4 ° C, onde será estável por algumas semanas. Antes de usar a F-actina novamente após o armazenamento, gentilmente inverterOu mexer várias vezes no tubo para assegurar que toda a actina seja dissolvida e uniformemente distribuída em solução. NOTA: (Opcional) Adicionar phalloidin para alcançar uma razão molar de 1: 1 de G-actina: phalloidin. Incubar durante 30 min à RT para permitir que a faloidina se ligue à F-actina. A phalloidin estabiliza a F-actina e realiza duas coisas: (i) reduz a quantidade de actina que não sedimenta durante a centrifugação e (ii) permite que a F-actina seja diluída abaixo da concentração crítica (~ 0,5 μM), que é frequentemente Necessário se variando a quantidade de F-actina para gerar uma curva de ligação (ver secção 5 na medição da afinidade). 4. Ensaio de granulação – Protocolo Básico NOTA: O protocolo básico descrito na secção 4 é utilizado para determinar se uma proteína de interesse co-sedimentos com F-actina. Uma vez estabelecida a ligação à F-actina, a afinidade desta interacção pode ser medida seguindo o protocolo descrito na secção 5. Preparar o tampão de reacção no dia da utilização diluindo o stock 10x para 1x e adicionar DTT a uma concentração final de 1 mM. NOTA: (Opcional) Adicionar polidocanol a uma concentração final de 0,02% no tampão de reacção. O Polidocanol é um tensioactivo que reduz a ligação de fundo não específica e ajuda a impedir que as proteínas hidrofóbicas se adiram ao tubo de ultracentrífuga. Diluir a proteína de interesse para as concentrações desejadas em 1x tampão de reação em tubos de ultracentrífuga. Mantenha os volumes de amostra baixos (40-60 μL) para evitar o uso de grandes quantidades de proteína usando tubos de ultracentrífuga com pequenos volumes mínimos ( por exemplo , tubos de 7 x 20 mm que contenham 0,2 mL cada). NOTA: Uma vez que muitas proteínas de ligação à actina têm uma afinidade para a actina F na gama micromolar, recomenda-se testar uma proteína de interesse a 2 e 10 μM. Se a ligação não for observada a 10 μM, é improvável que a ligação seja observada em concentrações mais elevadas. Se oA proteína adicionada constitui mais de 10-20% do volume final da reacção, pode ser necessário diálise da proteína no tampão de reacção antes de realizar a experiência. Adicionar F-actina à concentração final desejada. NOTA: 2 μM é uma concentração útil para experiências iniciais porque está bem acima da concentração crítica, mantendo assim a actina no estado filamentoso. Produzirá uma pastilha visível quando analisada por SDS-PAGE (passo 4.10). Preparar os seguintes controles em tubos de ultracentrífuga para tornar o ensaio informativo. Preparar amostra (s) contendo a proteína de interesse sem F-actina. Assegurar que a concentração de proteína nestas amostras corresponda à concentração nas amostras "plus F-actina". NOTA: Estas amostras determinarão a quantidade de proteína que é agregada ou presa aos lados do tubo de ultracentrífuga na ausência de F-actina. Preparar amostras de controlo negativoÀ mesma concentração ou concentrações semelhantes utilizadas para a proteína de interesse. Use uma proteína controle que não se ligue à F-actina, com e sem F-actina. NOTA: Este é um importante controle porque as proteínas podem se tornar "presas" em filamentos de actina e pellet com F-actina, mesmo que eles não se liguem à F-actina. A quantidade de aprisionamento pode variar dependendo da fonte de F-actina, condições de tampão, etc. Assim, este controlo deve ser incluído em todas as experiências. Idealmente, a proteína de controlo deve ter um peso molecular semelhante à proteína de interesse ( por exemplo , para aE-catenina (~ 100 kDa), a BSA (66 kDa) é um controlo apropriado). Os padrões de filtração de gel comercialmente disponíveis constituem proteínas de controlo excelentes, uma vez que cobrem uma gama de tamanhos e tendem a não conter agregados. Opcionalmente, preparar amostras de controlo positivo contendo uma proteína que se liga à F-actina, com e sem F-actina. Certifique-se de que a (s) concentração (ões) são semelhantes àsE proteína de interesse. NOTA: Este controlo é útil na medida em que demonstra que as condições experimentais ( eg, F-actina preparada, tampão de reacção e centrifugação) permitem a ligação da F-actina. Uma vez que o ensaio de peletização pode deixar de detectar interacções fracas de actina F (ver a Discussão), recomenda-se que a proteína de ligação à actina F conhecida tenha uma afinidade moderada a fraca pela actina F ( isto é, na gama micromolar baixa ). As proteínas de ligação a F-actina purificadas estão comercialmente disponíveis. Incubar todas as amostras durante 30 min à RT. NOTA: Os tempos de incubação mais longos são bons, assumindo que a proteína de interesse é estável, embora provavelmente desnecessária. Se a proteína de interesse não é estável à RT, então as amostras podem ser incubadas a 4 ° C. Neste caso, podem ser necessários tempos de incubação mais longos. Coloque as amostras no rotor da centrífuga. Posicionar os tubos dentro do rotor para auxiliar na ressuspensão do sedimento após a centrifugação.Para isso, marque todos os tubos de centrífuga ( por exemplo, com um número de amostra) e coloque todos os tubos no rotor na mesma posição ( por exemplo, o número voltado para fora). Centrifugar a 100 000 xg durante 20 min a 4 ° C numa ultracentrífuga. Após a centrifugação, retirar 3/4 do sobrenadante ( por exemplo , 45 μL se o volume inicial for 60 μL) de cada tubo e misturar com 1/3 volumes de tampão de amostra 4x (15 μL neste caso) num tubo de microcentrífuga separado. Remover o sobrenadante restante com uma ponta de carga de gel, tomando cuidado para não perturbar o sedimento (que pode ser visível como um ponto vítreo). NOTA: É importante remover o sobrenadante dos tubos o mais rapidamente possível após a conclusão da centrifugação para limitar a dissociação da proteína após a separação. Além disso, não lave o sedimento com tampão de reação pela mesma razão. Adicionar 4/3 volumes de 1x tampão de amostra a cada pelleT ( por exemplo , 80 μL se o volume de partida fosse 60 μL). NOTA: Isto faz com que a diluição seja a mesma que para o sobrenadante (passo 4.8, volumes de 1/3 de tampão de amostra 4x foram adicionados), permitindo a comparação directa entre as amostras de sedimento e sobrenadante e a determinação da percentagem de proteína que foi sedimentada. Adicionar tampão de amostra a todos os tubos e incubar durante pelo menos 5 min à RT. Permitir que o sedimento para sentar-se no buffer de amostra para melhorar a recuperação da amostra. Triturar a amostra 8-10 vezes com uma ponta de pipeta p200 para ressuspender o grânulo lavando continuamente a área do sedimento do tubo. Raspe suavemente a ponta da pipeta sobre a pastilha durante a trituração para ajudar na ressuspensão. NOTA: Tome cuidado para evitar a introdução de ar na amostra durante a trituração, pois isso fará com que o tampão de amostra borbulhe e reduza a recuperação da amostra. Transferir as amostras ressuspensas para tubos de microcentrífuga após a trituração. </ Ol> Analisar as amostras de sobrenadante e sedimento por SDS-PAGE e coloração com Coomassie 8 por carregamento de 10-15 μL de amostra por pista; Isso é suficiente para visualizar as proteínas. NOTA: Proteínas que co-sedimentam com F-actina serão enriquecidas nas amostras de "plus F-actina" sobre as amostras de pellet "sem F-actina" ( Figura 1A ). A coloração azul padrão de Coomassie é suficiente para a detecção se as concentrações de proteína estiverem na gama de 0,1-10 μM. Coloidal Coomassie 9 ou Western blotting pode ser utilizado para aumentar a sensibilidade se forem utilizadas concentrações de proteína mais baixas para medir interacções de maior afinidade. Image Coomassie-manchou géis usando um scanner ou sistema de imagem (passo 5.12). 5. Ensaio de granulação – Quantificação Nota: Se for observada a ligação específica à F-actina, pode ser útil medir a afinidade de tInteração. Isto é conseguido fazendo algumas alterações e adições ao protocolo delineado na secção 4. Para um excelente guia para a concepção e interpretação de ensaios de ligação, consulte Pollard 10 . Um fluxograma ( Figura 2 ) é fornecido para assistência com a análise e quantificação. Determine a faixa de concentração a ser testada. NOTA: A gama de concentrações dependerá da proteína e deverá abranger desde uma concentração abaixo do Kd aparente ( por exemplo, 1 μM) até concentrações suficientemente elevadas para saturar a ligação. É crítico que a ligação chegue à saturação em múltiplas amostras na extremidade superior da gama de concentração para gerar uma curva de ligação exacta ( Figura 1C ). Como mencionado acima, muitas proteínas de ligação à actina têm afinidade para a actina F na gama micromolar baixa (1-5 uM). Para uma proteína com um Kd de 0,5-1 μM, uma gama de concentração de partida útil seria 0,1-10 μM. Hard spin (passo 2.3) a proteína de interesse para remover agregados. Serialmente diluir a proteína para fazer uma série de concentração contendo 7-8 amostras a 2x a concentração final a ser testado. Por exemplo, se o intervalo a testar for de 0,1 a 8 μM, preparar as seguintes diluições em tampão de reacção 1x: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,2 μM. NOTA: Tal como mencionado no passo 4.2, se a proteína adicionada for superior a 10% -20% da primeira diluição (a amostra de 16 μM no exemplo acima), pode ser necessário concentrar a proteína ou dializar a Em 1x tampão de reacção. Certifique-se de preparar o suficiente de cada diluição para "mais F-actina" e "nenhuma F-actina" amostras. Preparar amostras (como na secção 4), diluindo a proteína de interesse para as concentrações desejadas em 1x tampão de reacção em tubos de ultracentrífuga. Mantenha os volumes de amostra baixos (40-60 μL) para evitar o uso de grandes quantidades de proteína usando ultracentrosTubos de irrigação com pequenos volumes mínimos ( por exemplo , tubos de 7 x 20 mm que contenham 0,2 mL cada). Adicionar F-actina à concentração final desejada para as amostras apropriadas e aumentar o volume utilizando 1x tampão de reacção. Por exemplo, para reacções de 50 μL utilizando 2 μM de actina F, certifique-se de que cada amostra contém 25 μL de proteína 2x, 10 μL de actina F 10 μM e 15 μL de tampão de reacção 1x. Incluir amostras de controlo (passos 4.4.2 e 4.4.3). NOTA: Para os controlos negativo e positivo, utilize uma concentração dentro da gama a ser testada (passo 5.1), idealmente perto do meio até ao extremo superior da gama ( por exemplo, 4 μM se a gama de concentração for de 0,1-10 μM). Incubar todas as amostras durante 30 min à RT. Após 30 min, remover 1/5 de cada amostra ( por exemplo, 10 μL da reação de 50 μL) e misturar com 20 μL de água e 10 μL de tampão de amostra 4x. NOTA: Estes são os "Total" sE serão usados ​​para gerar uma curva padrão. Coloque as amostras no rotor da ultracentrífuga. Centrifugar durante 20 min a 100 000 xg e 4 ° C. Opcionalmente, após centrifugação, retire 3/4 do sobrenadante ( por exemplo, 30 μL se o volume centrifugado for 40 μL) de cada tubo e misture com 4x tampão de amostra (10 μL neste caso) num tubo de microcentrífuga separado. Remover o sobrenadante remanescente com uma ponta de carga de gel, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. NOTA: Quando se mede a afinidade de ligação, não é necessário executar o sobrenadante. No entanto, pode ser útil guardar o sobrenadante, especialmente quando se testa uma nova proteína. Remover o sobrenadante se não analisar (passo 5.7). Ressuspender o sedimento em 1 volume de 1x tampão de amostra ( por exemplo, 40 μL se o volume centrifugado for 40 μL). Adicionar tampão de amostra a todos os tubos e incubar durante pelo menos 5 min à RT. TrIturar a amostra 8-10 vezes com uma ponta de pipeta p200, lavando continuamente a área do sedimento do tubo. Raspe suavemente a ponta da pipeta sobre a pastilha durante a trituração para ajudar na ressuspensão. Transferir a proteína ressuspendida para um tubo de microcentrífuga. NOTA: Estas são as amostras "Pellet". Analisar as amostras de Total e Pellet por SDS-PAGE 8 . Executar todas as amostras em um gel, se possível; Se não, execute as amostras de peletes num gel e as amostras totais num segundo. NOTA: Dado o número de amostras, um sistema de gel grande é recomendado para análise. Se estiver a correr amostras em dois ou mais géis, é importante que todos os géis sejam corados de forma idêntica ( isto é, a mesma solução de Coomassie e um tempo idêntico em mancha / destain). Image Coomassie-géis manchados usando um sistema de imagem que mede a intensidade da banda de proteína em uma ampla ( ou seja, um de dois a três log) e intervalo linear. Certifique-se de que as imagensSão recolhidos sem pixels saturados. NOTA: Os sistemas de imagem baseados em laser oferecem a melhor sensibilidade e relação sinal / ruído. Usando ImageJ ou um programa de análise semelhante, medir a intensidade da banda de proteína e calcular a quantidade de proteína ligada. NOTA: Para todas as medições de amostra, use a ferramenta de seleção em ImageJ para desenhar uma região de interesse (ROI) ao redor de cada faixa e medir (analisar> Medir) a área eo valor de cinza médio. Calcule o fundo para cada gel medindo o valor médio de cinza de uma área sem amostra. Subtraia o valor de cinza médio de fundo de cada valor de cinza médio de ROI e, em seguida, multiplique pela área para obter o valor de densidade integrado para cada banda. Medir a proteína de intensidades de banda de interesse a partir das amostras Total ( Figura 2A ). Gerar uma curva padrão representando a intensidade da banda ( isto é, as medições de densidade integrada) versus a massa da proteína ( Figura2B). Medir a quantidade de proteína de interesse que co-sedimentado com F-actina (proteína co-sedimentada, Figura 2C ). Medir a quantidade de proteína de interesse que sedimentou na ausência de F-actina (sedimentação de fundo, Figura 2D ). Subtrair a sedimentação de fundo da proteína co-sedimentada ( isto é, subtrair os valores do passo 5.13.4 do passo 5.13.3) para determinar a quantidade de proteína que se liga à F-actina. Medir a quantidade de F-actina em cada pellet ( Figura 2E ). Determine a quantidade média de F-actina por amostra e, em seguida, divida cada amostra pela média para determinar a razão de F-actina em cada amostra em relação à média ( isto é, os números abaixo das faixas). Para cada amostra, divida a quantidade de proteína ligada (calculada no passo 5.13.5) pela proporção de peletes de actina F actina (passo 5.13.6) para ajustar as diferenças no grânulo. NOTE: Este valor é a proteína ligada normalizada. Utilize a curva padrão (passo 5.13.2) para calcular a quantidade (massa) de proteína ligada normalizada (passo 5.13.7) em cada amostra. NOTA: A proteína removida inicialmente (a amostra "Total"), bem como a quantidade carregada (que, a menos que toda a pastilha tenha sido carregada, será uma fracção da pastilha), deve ser contabilizada ao calcular a quantidade total de proteína Que peletizou. Determine a concentração de proteína ligada em cada amostra a partir da massa total de proteína na pastilha (calculada no passo 5.13.8) e o volume da amostra. Subtrair este valor da concentração de partida para determinar a quantidade de proteína livre. Dividir a concentração de proteína ligada pela concentração de actina (μM / μM de actina) eo gráfico versus a concentração de proteína livre para gerar uma curva de ligação ( Figura 1C ). OBSERVAÇÃO: Como a F-actina não é uma espécie única e uniforme,Culto para extrapolar a concentração molar de F-actina a partir da concentração de G-actina. Utilizar a concentração inicial de G-actina para determinar a quantidade de proteína ligada (μM / μM de actina) e estimar a concentração aparente de locais de ligação na reacção. A concentração de locais de ligação é normalmente menor do que a concentração de monómeros de actina na reacção porque nem toda a actina polimeriza e porque uma única molécula de proteína de ligação a actina pode fazer contacto com múltiplos monómeros no filamento de actina. Usando um programa estatístico, determine a afinidade (K d ) e Bmax da curva de ligação usando regressão não-linear de mínimos quadrados. NOTA: As parcelas de Scatchard são desencorajadas para analisar dados de ligação, em parte porque podem obscurecer se a ligação está saturada e porque podem distorcer o erro experimental 10 .