Ko-çöktürme yoluyla F-aktine Bağlı Proteinin Ölçülmesi

1. Malzemeleri hazırlayın İlgili proteini arındırın (bkz. Bölüm 2). G-actin hazırlayın veya satın alın. NOT: G-actin birden fazla kaynaktan izole edilebilir 1 ; Alternatif olarak, satın alınabilir. Yeniden yapılandırılmış G-aktin (5 mM Tris pH 8.0, 0.2 mM CaCl2, 0.2 mM ATP (adenosin trifosfat) ve 0.5 mM ditiyotreitol (DTT) içinde) -80 ° C'de hızlı dondurulmalı ve> 10 mg / mL Küçük (10-20 uL) alikuotlar halinde ve kullanımdan hemen önce çözülmüştür. G-aktin alikotları yeniden soğutulmamalıdır. BSA gibi bir kontrol proteini hazırlayın veya satın alın (bkz. Adım 4.4). 10x polimerizasyon tamponu (200 mM imidazol pH 7.0, 1 M KCI, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP ve 10 mM EGTA (etilen glikol-bis (p-aminoetil eter) -N, N, N ', N'- Tetraasetik asit)). Gerekirse ATP eklenmesinden sonra 10x stok yapın ve pH değerini ayarlayın. Kısım (25 μL yararlı bir hacim) ve -80 de saklayın #176 ° C. 10x reaksiyon tamponu (200 mM imidazol pH 7.0, 1.5 M NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP ve 10 mM EGTA) hazırlayın. Gerekirse ATP eklenmesinden sonra 10x stok yapın ve pH değerini ayarlayın. Kısım (50-100 μL faydalı bir hacimdir) ve -80 ° C'de saklayın. NOT: Tepkime tamponunun bileşimi esnektir ve zemin sedimantasyonunu azaltmak, spesifik olmayan bağlanmayı sınırlandırmak ve / veya bağlanmayı iyileştirmek için ayarlanması gerekebilir (basamaklar 1.5.1-1.5.3). Protein stabilitesini optimize etmek için reaksiyon tamponunun pH değerini 6 ile 8 arasında ayarlayın. Daha düşük veya daha yüksek bir pH'da, imidazol için uygun bir tampon maddesi koyun. NOT: Bir protein stabilite için daha düşük veya daha yüksek bir pH gerektirmediği sürece pH 7,0'ı başlangıç ​​noktası olarak kullanın. Faktinin bozulmasına neden olabileceğinden pH'ın 6.0'ın altında veya 8.0'ın üstünde bir tampon kullanmayın. Tavsiye edilen tamponlar (nihai konsantrasyon ve listelenen en uygun pH) aşağıdakileri içerir: 20 mM MOPS (3- ( N- morfolino) propansülfonik asit), pH= 6.5; 20 mM imidazol, pH = 7.0; 10 mM HEPES (4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit), pH = 7.5; Ve 20 mM Tris, pH = 8.0. Testin ihtiyaçlarına bağlı olarak reaksiyon tamponunun tuz konsantrasyonunu değiştirin. NOT: Aktin asidik bir proteindir ve neredeyse tüm aktin-bağlayıcı proteinler, aktin ile ilişkilendirmek için elektrostatik etkileşimler üzerinde bir dereceye kadar güvenirler. Bu nedenle, çoğu durumda tuz konsantrasyonunun arttırılması aktin bağlanmasını azaltır. Reaksiyon tamponu, fizyolojik bir tuz düzeyini (150 mM NaCl, çalışma konsantrasyonu) kullanır ve bu önerilen başlangıç ​​noktasıdır. Gerekirse, bağlanmayı artırmak için tuz konsantrasyonu düşürülebilir ( örn., 100 mM'ye kadar) veya bağlanmayı sınırlandırmak için arttırılabilir. Bunun için özel bir sebep yoksa, reaksiyon tamponu içindeki MgCl2, ATP veya EGTA konsantrasyonlarını değiştirmeyin. 2. Deney için Test Proteinini Hazırlayın preparEn iyi sonuçlar için sıvı kromatografisini kullanarak yüksek saflıkta protein 7 . NOT: Eğer rekombinant protein kullanılıyorsa, glutatyon-S-transferaz (GST) gibi büyük protein etiketleri, bağlanmaya müdahele edebildiği için hedef proteinden proteaz klivajı ile uzaklaştırılmalıdır. GST ayrıca füzyon proteinlerinin homodimerizasyona neden olur, bu da yapay olarak aktin bağlanmasının afinitesini artırabilir. 280 nm'de absorbansı ölçerek protein konsantrasyonunu belirleyin. Sönüm katsayısı ile bölün; Sönüm katsayısı, sekans analizi veya çevrimiçi araçlar kullanarak protein sekansından hesaplanabilir. Alternatif olarak, Bradford veya BCA (bicinchoninic acid) yöntemlerini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. NOT: İlk deneyler için genellikle 20-40 μM'de 50-100 μL protein yeterlidir. Bu, aktin bağlayıcı proteinlerin çoğu için yararlı bir başlangıç ​​noktası olan düşük mikromolar aralıktaki bağlanmanın analiz edilmesini sağlayacaktır. Daha büyük bir quanYakınlığın hesaplanması için bir bağlanma eğrisi üretmek için daha yüksek bir protein konsantrasyonuna ihtiyaç duyulmaktadır (bkz. Bölüm 5). Çözülmeyen proteinin agregalarını çıkartmak için protein kullanılmadan hemen önce proteini sıkıca döndürün (50,000-100,000 xg, 10 dakika süreyle 4 ° C'de). Çözünürlük bir endişe kaynağı ise, santrifüjden sonra protein konsantrasyonunu yeniden ölçün (adım 2.2). 3. F-aktini hazırlayın -80 ° C derin dondurucudan bir alikot G-aktini çıkarın ve çabucak çözdürün. 10x polimerizasyon tamponu G-aktin'e son konsantrasyonu 1x'e ekleyin. 1x polimerizasyon tamponundaki G-aktin konsantrasyonunun, kritik konsantrasyonun çok üzerinde en az 10-20 μM olmasını sağlayın. Aktinin polimerleşmesine izin vermek için oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin. Polimerizasyondan sonra, F-aktini solüsyonda 4 ° C'de saklayın; burada birkaç hafta stabil kalacaktır. Depolamadan sonra F-aktini tekrar kullanmadan önce, hafifçe ters çevirinVeya tüm aktinin eritildiğinden ve çözelti içinde düzgün şekilde dağıldığından emin olmak için tüpü birkaç kez hafifçe vurun. NOT: (İsteğe bağlı) 1: 1 molar oranda G-aktin: phalloidin elde etmek için phalloidin ekleyin. Phalloidin'in F-actin'e bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Phalloidin, F-aktini stabilize eder ve iki şeyi yerine getirir: (i) santrifüj sırasında tortulanmayan aktin miktarını azaltır ve (ii) F-aktinin, kritik konsantrasyonun (~ 0.5 uM) altında seyreltilmesine izin verir, Bir bağlanma eğrisi üretmek için F-aktin miktarını değiştirirse gereklidir (afiniteyi ölçmek için bölüm 5'e bakınız). 4. Pelletleme Deneyi – Temel Protokol NOT: Bölüm 4'te açıklanan temel protokol, ilgi konusu bir proteinin F-aktin ile birlikte sedimant olup olmadığını belirlemek için kullanılır. F-aktine bağlanma yapıldıktan sonra, bu etkileşimin afinitesi, bölüm 5'de açıklanan protokolü izleyerek ölçülebilir. Tepkime tamponu kullanım gününü, 10x stoğu 1x'e seyrelterek hazırlayın ve 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar DTT ekleyin. NOT: (İsteğe bağlı) Polidokanol, reaksiyon tamponu içinde% 0.02'lik bir nihai çalışma konsantrasyonuna ilave edilir. Polidokanol, spesifik olmayan arka plan bağlanmayı azaltan ve hidrofobik proteinlerin ultra-santrifüj tüpüne yapışmasını önlemeye yardımcı olan bir yüzey aktif maddedir. İlgili proteini, ultra santrifüj tüplerinde 1x reaksiyon tamponunda istenen konsantrasyonlara seyreltin. Minimum asgari hacimlerdeki ultra santrifüj tüpleri ( örneğin , her biri 0,2 mL tutan 7 x 20 mm tüpler) kullanarak büyük protein miktarlarını kullanmaktan kaçınmak için numune hacmini düşük tutun (40-60 μL). NOT: Birçok aktin bağlayıcı proteinin mikromolar aralıkta F-aktin'e yakınlığı olduğundan, 2 ve 10 uM'lik bir ilgi çekici bir proteinin test edilmesi önerilir. 10 uM'de bağlanma gözlemlenmiyorsa, bağlantının daha yüksek konsantrasyonlarda gözlenmesi olası değildir. EğerEklenen protein, nihai reaksiyon hacminin% 10-20'sini oluşturduğundan, deney yapılmadan önce proteini reaksiyon tamponu içine diyalize etmeniz gerekebilir. İstenen son konsantrasyona F-aktin ekleyin. NOT: 2 μM, başlangıç ​​deneyleri için yararlı bir konsantrasyondur çünkü kritik konsantrasyonun çok üstündedir, böylece filament halindeki aktini muhafaza eder. SDS-PAGE ile analiz edildiğinde görünür pelet üretecektir (adım 4.10). Deneyi bilgilendirici yapmak için aşağıdaki kontrolleri ultra santrifüj tüplerinde hazırlayın. F-aktin olmadan ilgilenilen proteini içeren örnek (ler) hazırlayın. Bu örneklerdeki protein konsantrasyonunun "artı F-aktin" örneklerindeki konsantrasyonla eşleştiğinden emin olun. NOT: Bu numuneler, F-aktin yokluğunda ultra santrifüj tüpünün kenarlarına bir araya getirilen veya sıkışmış protein miktarını belirleyecektir. Negatif kontrol örnekleri hazırlayınIlgi protein için kullanılan aynı veya benzer konsantrasyonlarda. F-aktin ile veya F-aktin olmadan F-aktin'e bağlanmayan bir kontrol proteini kullanın. NOT: Bu önemli bir kontroltür, çünkü proteinler aktin filamentlerinde "sıkıştırabilir" ve F-aktini bağlamasa da F-aktin ile topaklar haline gelebilir. Yakalama miktarı, F-aktin kaynağına, tampon koşullarına vb . Bağlı olarak değişebilir. Dolayısıyla bu kontrol, tüm deneylerde dahil edilmelidir. İdeal olarak, kontrol proteininin ilgilenilen proteine ​​benzer bir molekül ağırlığı olmalıdır ( örn. , ΑE-katenin (~ 100 kDa) için, BSA (66 kDa) uygun bir kontroltür). Ticari olarak temin edilebilen jel filtrasyon standartları mükemmel kontrol proteinlerini üretir; çünkü bunlar bir dizi ebadı kapsar ve agrega içermeme eğilimindedir. İsteğe bağlı olarak, F-aktin ile veya F-aktin olmadan F-aktin'e bağlanan bir protein içeren pozitif kontrol örnekleri hazırlayın. Konsantrasyonun, bu konsantrasyonunE protein. NOT: Bu kontrol, deneysel koşulların ( örn. Hazırlanmış F-aktin, reaksiyon tamponu ve santrifüj) F-aktin bağlanmasına izin verdiğini göstermesi açısından yardımcıdır. Peletleme deneyi, zayıf F-aktin etkileşimlerini saptamayı başaramadığı için (bkz. Tartışma), bilinen F-aktin bağlayıcı proteinin F-aktin için orta ila zayıf bir yakınlığa ( yani, düşük mikromolar aralıkta) sahip olması önerilir ). Saflaştırılmış F-aktin bağlama proteinleri ticari olarak mevcuttur. Tüm numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. NOT: Olasılıkla gereksiz olmasına rağmen, ilgilenilen proteinin sabit olduğu varsayılarak daha uzun inkübasyon süreleri uygundur. Eğer ilgilenilen protein RT'de stabil değilse, numuneler 4 ° C'de inkübe edilebilir. Bu durumda, inkübasyon süreleri daha uzun olabilir. Örnekleri santrifüj rotoruna yükleyin. Santrifüjden sonra pelet yeniden süspansiyona yardımcı olmak için tüpleri rotorun içine yerleştirin.Bunun için tüm santrifüj tüplerini işaretleyin ( örn. Numune numarası ile) ve tüm tüpleri rotor içine aynı konuma getirin ( örneğin, numara dışarı bakacak şekilde). Ultracentrifuge'de 4 ° C'de 20 dakika 100,000 xg'de santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, her tüpten yüzer maddenin 3 / 4'ünü ( örneğin , başlangıç ​​hacmi 60 mcL olan 45 mcL) çıkarın ve ayrı bir mikrosantrifüj tüpünün 1/3 hacimdeki 4x örnek tamponu (bu durumda 15 mcL) ile karıştırın. Geriye kalan süpernatanı, pelleti (camsı bir nokta olarak görülebilir) rahatsız etmemeye özen gösteren bir jel yükleme ucu ile çıkarın. NOT: Ayrıştırma sonrasında protein ayrışmasını sınırlamak için, santrifüjün tamamlanmasından sonra, süpernatıttan tüplerden mümkün olduğunca çabuk çıkarmak önemlidir. Ayrıca, aynı nedenden dolayı tepkime tamponuyla topağı yıkamayın. Her pelleğe 4/3 hacim 1x örnek tamponu ekleyinT (başlangıç ​​hacmi 60 μL ise 80 μL). NOT: Bu, seyreltmeyi süpernatant ile aynı yapar (pelet ve süpernatan numuneleri arasında doğrudan kıyaslama yapılmasına ve peletlenen proteinin yüzdesinin belirlenmesine izin verilerek adım 4,8, 1/4 hacim 4x örnek tampon eklenmiştir). Tüm tüplere örnek tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında en az 5 dakika inkübe edin. Örnek geri kazanımını iyileştirmek için topağın örnek tamponuna oturmasına izin verin. Tüpün pelet alanını sürekli olarak yıkayarak topağı yeniden askıya almak için numuneyi bir p200 pipet ucu ile 8-10 kez toz haline getirin. Yeniden süspansiyon ile yardımcı olmak için toz haline getirme sırasında pelet üzerindeki pipet ucunu yavaşça kazın. NOT: öğütme sırasında numuneye hava girmesini önlemek için dikkat edin, çünkü numune tamponunun kabarcık oluşturmasına ve numunenin geri kazanımını azaltmasına neden olur. Öğütülmeden sonra yeniden süspanse edilen numuneleri mikro huniye tüplerine aktarın. </ Ol> Şerit başına 10-15 μL örnek yükleyerek SDS-PAGE ve Coomassie boyama 8 ile süpernatan ve topak numunelerini analiz edin; Bu proteinleri görselleştirmek için yeterlidir. NOT: F-aktin ile birlikte çökelen proteinler, "F-aktin" yoksun topak örnekleri üzerinde "artı F-aktin" pelet örneklerinde zenginleştirilir ( Şekil 1A ). Standart Coomassie mavisi boyama protein konsantrasyonları 0.1-10 μM aralığında ise saptama için yeterlidir. Düşük afiniteli etkileşimleri ölçmek için düşük protein konsantrasyonları kullanılırsa, Colloidal Coomassie 9 veya Western blotlama hassasiyeti artırmak için kullanılabilir. Image Bir tarayıcı veya görüntüleme sistemi kullanarak Coomassie boyalı jelleri (adım 5.12). 5. Peletleme Deneyi – Niceleme Not: F-aktine spesifik bağlanma gözlemleniyorsa, t nin afinitesini ölçmekO etkileşim. Bu, 4. bölümde özetlenen protokole birkaç değişiklik ve ekleme yaparak gerçekleştirilir. Bağlama analizlerini tasarlamak ve yorumlamak için mükemmel bir kılavuz için bkz. Pollard 10 . Analiz ve miktar tayini için yardım için bir akış şeması ( Şekil 2 ) sağlanmıştır. Test edilecek konsantrasyon aralığını belirleyin. NOT: Konsantrasyon aralığı, proteine ​​bağlıdır ve görünür Kd'nin ( örn., 1 uM) altındaki bir konsantrasyondan bağlanmayı doyurmaya yetecek kadar konsantrasyona kadar yayılmalıdır. Doğru bir bağlanma eğrisi oluşturmak için ( Şekil 1C ), bağlanmanın konsantrasyon aralığının üst ucundaki çok sayıda numunede bağlanmanın doygunluğa ulaşması kritiktir. Yukarıda belirtildiği gibi, birçok aktin-bağlayıcı protein düşük mikromolar aralıkta (1-5 uM) F-aktin için bir afiniteye sahiptir. 0.5-1 uM bir Kd'ye sahip bir protein için, yararlı bir başlangıç ​​konsantrasyon aralığı, 0.1-10 uM. Agregaları çıkarmak için katı spin (adım 2.3) ilgilenilen protein. Test edilecek nihai konsantrasyondaki 2x'de 7-8 örnek içeren bir konsantrasyon serisi yapmak için proteini ciddi olarak seyreltin. Örneğin, test edilecek aralık 0.1-8 μM ise, aşağıdaki seyreltileri 1x reaksiyon tamponu içerisinde hazırlayın: 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 ve 0.2 uM. NOT: Adım 4.2'de belirtildiği gibi, eklenen protein ilk seyreltmenin (yukarıdaki örnekte 16 uM numune)% 10 -% 20'sini oluşturursa, ya proteini konsantre hale getirmek ya da 1x reaksiyon tamponuna ilave edin. "Artı F-aktin" ve "hayır F-aktin" örnekleri için her seyreltmeden yeterince hazırladığınızdan emin olun. İlgili proteini ultra santrifüj tüplerinde 1x reaksiyon tamponu içerisinde istenen konsantrasyonlara seyrelterek örnekler hazırlayın (bölüm 4'te olduğu gibi). Ultracent kullanarak büyük miktarlarda protein kullanmaktan kaçınmak için numune hacimlerini düşük (40-60 μL) tutunKüçük asgari hacimlerdeki rifuge tüpleri ( örneğin , her biri 0.2 mL tutan 7 x 20 mm tüpler). Uygun numunelere istenen nihai konsantrasyona F-aktin ekleyin ve 1x reaksiyon tampon kullanarak hacmi getirin. Örneğin, 2 uM F-aktin kullanarak 50 μL reaksiyonlar için, her bir numunenin 2x protein 25 mcL, 10 uL 10 uM F-aktin ve 15 uL 1x reaksiyon tamponu içerdiğinden emin olun. Kontrol numunelerini ekleyin (adım 4.4.2 ve 4.4.3). NOT: Negatif ve pozitif kontroller için, test edilecek aralıkta (adım 5.1), ideal olarak aralığın orta ila üstünün yakınında ( örn . Konsantrasyon aralığı 0.1-10 μM ise 4 uM) bir konsantrasyon kullanın. Tüm numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, her numunenin 1 / 5'ini ( örneğin, 50 μL reaksiyonun 10 uL'si) çıkarın ve 20 mcL su ve 10 mcL 4x numune tamponu ile karıştırın. NOT: Bunlar "Toplam" larVe standart eğri oluşturmak için kullanılacaktır. Numuneleri ultra-santrifüj rotoruna yükleyin. 100.000 xg ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. İsteğe bağlı olarak, santrifüjden sonra, her tüpten yüzer maddenin 3 / 4'ünü ( ör., Santrifüj hacmi 40 mcL olan 30 mcL) kaldırın ve ayrı mikrofüj tüpünde 4x numune tamponu (bu durumda 10 mcL) ile karıştırın. Geriye kalan süpernatanı, pelleti rahatsız etmemeye özenerek bir jel yükleme ucu ile çıkarın. NOT: Bağlanma afinitesi ölçülürken, süpernatanın çalıştırılması gerekli değildir. Yine de, özellikle yeni bir proteini test ederken süpernatanı kurtarmak yararlı olabilir. Analiz edilmezse süpernatanı çıkarın (adım 5.7). Pelet 1 hacim 1x örnek tampon ( örneğin, santrifüj hacmi 40 mcL ise 40 mcL) tekrar süspansiyon haline getirin. Tüm tüplere örnek tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında en az 5 dakika inkübe edin. TrNumuneyi, bir p 200 pipet ucu ile 8-10 kez yineleyin, tüpün pelet alanını sürekli olarak yıkayın. Yeniden süspansiyon ile yardımcı olmak için toz haline getirme sırasında pelet üzerindeki pipet ucunu yavaşça kazın. Yeniden askıdaki proteini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: Bunlar "Pelet" örnekleridir. Total ve Pellet örneklerini SDS-PAGE 8 ile analiz edin. Mümkünse tüm numuneleri tek bir jel üzerinde çalıştırın; Yoksa, bir jeldeki pellet örneklerini ve saniyedeki toplam örnekleri çalıştırın. NOT: Numunelerin sayısına bakıldığında, analiz için büyük bir jel sistemi önerilir. İki veya daha fazla jel üzerinde numuneler çalıştırılıyorsa, tüm jellerin aynı şekilde boyanması önemlidir ( yani, aynı Coomassie çözeltisi ve aynı zamanda leke / destain içinde). Görüntü geniş bantlı yoğunluğu ( yani iki veya üç günlük) ve doğrusal aralıkta ölçen bir görüntüleme sistemi kullanarak Coomassie boyalı jelleri. Resimlerinizin bir veyaDoymuş piksel olmadan toplandı. NOT: Lazer tabanlı görüntüleme sistemleri en iyi hassasiyet ve sinyal-gürültü oranlarını sunar. ImageJ veya benzeri bir analiz programı kullanarak, protein bant yoğunluklarını ölçün ve bağlı protein miktarını hesaplayın. NOT: Tüm örnek ölçümler için, her bandın etrafında bir ilgi alanı (ROI) çizmek ve alanı (grafiğin ortalama değerini ölçün) ölçmek için ImageJ'deki seçim aracını kullanın. Örnek olmayan bir alanın ortalama gri değerini ölçerek her bir jel için arka planı hesaplayın. Her ROI ortalama gri değerden arka plan ortalama gri değerini çıkarın ve daha sonra her bir bant için entegre yoğunluk değerini elde etmek için alanla çarpın. Toplam örneklerden ilgi band yoğunluklarının proteinini ölçün ( Şekil 2A ). Band yoğunluğunu ( yani entegre yoğunluk ölçümleri) protein kütlesi karşısında çizerek standart bir eğri oluşturun ( Şekil2B). F-aktin ile birlikte çökeltilen ilgi protein miktarını ölçün (birlikte çöktürülmüş protein, Şekil 2C ). F-aktin yokluğunda tortulaştırılan ilgi protein miktarını ölçün (arka plan sedimantasyonu, Şekil 2D ). F-aktine bağlanan proteinin miktarını belirlemek için birlikte sedimantasyonlu proteinin arka plan çökmesini çıkartın ( yani, 5.13.4 adımından 5.13.4 adımından çıkarın). Her pelet içindeki F-aktin miktarını ölçün ( Şekil 2E ). Her numune için F-aktinin ortalama miktarını belirleyin ve her örneği ortalamaya bölünerek, her bir numunedeki F-aktin oranını ortalamayla ( yani, bantların altındaki sayıları) ölçün. Her numune için, pelet içindeki farklılıkları ayarlamak için bağlı protein yüzdesini (adım 5.13.5'te hesaplanan) F-aktin aktin pelet oranı ile bölün (adım 5.13.6). N-OTE: Bu değer, normalleştirilmiş bağlı proteintir. Her bir numunede normalleştirilmiş bağlı proteinin miktarını (kütle) hesaplamak için standart eğrisi (adım 5.13.2) kullanın (adım 5.13.7). NOT: Başlangıçta çıkarılan protein ("Toplam" numune) yanı sıra yüklenen miktar (tüm pelet yüklenmedikçe, pelletin bir kısmı olacaktır) toplam protein miktarını hesaplarken hesaba katılmalıdır Peletlenen bu. Pellet içindeki toplam protein kütlesi (adım 5.13.8'de hesaplanan) ve numunenin hacminden her bir numunedeki bağlı proteinin konsantrasyonunu belirleyin. Serbest protein miktarını belirlemek için başlangıç ​​konsantrasyonundan bu değeri çıkarın. Bağlanan protein konsantrasyonunu aktin (μM / μM aktin) konsantrasyonuna bölün ve bir bağlanma eğrisi oluşturmak için serbest protein konsantrasyonuna karşı çizim yapın ( Şekil 1C ). NOT: F-aktin tek bir üniform olmayan tür olmadığından,Kült, F-aktinin molar konsantrasyonunu G-aktin konsantrasyonundan çıkarır. Bağlanan protein miktarını (μM / μM aktin) belirlemek için başlangıç ​​G-aktin konsantrasyonunu kullanın ve reaksiyondaki bağlanma bölgelerinin belirgin konsantrasyonunu hesaplayın. Bağlanma sahalarının konsantrasyonu genellikle reaksiyonda aktin monomerlerinin konsantrasyonundan daha düşüktür çünkü tüm aktin polimerize değildir ve tek bir aktin bağlayıcı protein molekülü aktin filament üzerinde çoklu monomerler ile temasa geçebilir. İstatistiksel bir program kullanarak doğrusal olmayan en küçük kareler regresyonunu kullanarak bağlanma eğrisinden afiniteyi (Kd) ve Bmax değerini belirleyin. NOT: Scatchard arazileri, bağlanma verilerini analiz etmek için caziptir çünkü kısmen bağlanma doymuş olup olmadığını belirsizlik gösterebilir ve deney hatasını 10 bozabilir.