Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie

1. Bereid de materialen voor Zuiver het eiwit van belang (zie rubriek 2). Bereid of koop G-actin. OPMERKING: G-actine kan geïsoleerd worden uit meerdere bronnen 1 ; Als alternatief kan het worden gekocht. Gekonstitueerde G-actine (in 5 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM ATP (adenosine trifosfaat) en 0,5 mM dithiothreitol (DTT)) moeten worden gevriesd, opgeslagen bij -80 ° C en> 10 mg / ml In kleine (10-20 μL) porties, en ontdooid net voor gebruik. G-actin-aliquots mogen niet worden gesezen. Bereid of koop een controle eiwit, zoals BSA (zie stap 4.4). Bereid 10x polymerisatiebuffer (200 mM imidazool pH 7,0, 1 M KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP en 10 mM EGTA (ethyleenglycol-bis (P-aminoethylether) -N, N, N ', N'- Tetraazijnzuur)). Maak een 10x voorraad en pas de pH aan na aanpassing van ATP, indien nodig. Aliquot (25 μL is een bruikbaar volume) en opslaan bij -80 & #176; C. Bereid 10x reactiebuffer (200 mM imidazool pH 7,0, 1,5 M NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP en 10 mM EGTA). Maak een 10x voorraad en pas de pH aan na aanpassing van ATP, indien nodig. Aliquot (50-100 μL is een bruikbaar volume) en opslaan bij -80 ° C. OPMERKING: De samenstelling van de reactiebuffer is flexibel en kan worden aangepast om de achtergrond sedimentatie te verminderen, niet-specifieke binding te beperken en / of binding te verbeteren (stappen 1.5.1-1.5.3). Pas de pH van de reactiebuffer tussen 6 en 8 aan om de stabiliteit van de eiwitten te optimaliseren. Bij een lagere of hogere pH, vervang een geschikte buffer voor imidazol. OPMERKING: Gebruik de pH 7.0 als uitgangspunt, tenzij een eiwit een lagere of hogere pH voor stabiliteit vereist. Gebruik geen buffer met een pH lager dan 6,0 of hoger dan 8,0, omdat dit de actine kan verstoren. Aanbevolen buffers (eindconcentratie en optimale pH genoemd) omvatten: 20 mM MOPS (3- ( N- morpholino) propaan-sulfonzuur), pH= 6,5; 20 mM imidazool, pH = 7,0; 10 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethaansulfonzuur), pH = 7,5; En 20 mM Tris, pH = 8,0. Varieer de zoutconcentratie van de reactiebuffer, afhankelijk van de behoeften van de test. OPMERKING: Actin is een zuur eiwit, en bijna alle actine-bindende eiwitten zijn in zekere mate afhankelijk van elektrostatische interacties om te associëren met actine. Daarom vermindert de toename van de zoutconcentratie de actinbinding in de meeste gevallen. De reactiebuffer maakt gebruik van een fysiologisch gehalte aan zout (150 mM NaCl, werkconcentratie) en dit is het aanbevolen uitgangspunt. Indien nodig kan de zoutconcentratie verlaagd worden ( bijv. Tot 100 mM) om binding te bevorderen of te verhogen om de binding te beperken. Verander de concentraties MgCl2, ATP of EGTA niet in de reactiebuffer, tenzij er specifieke redenen zijn om dit te doen. 2. Bereid het testproteïne voor de test op VoorbereiEa hoge zuiverheid eiwit met behulp van vloeistofchromatografie voor de beste resultaten 7 . OPMERKING: Als u recombinante eiwitten gebruikt, dienen grote proteïne-labels, zoals glutathion-S-transferase (GST), te worden verwijderd door proteasesplyting uit het doelproteïne, aangezien ze bindend kunnen zijn. GST veroorzaakt ook homodimerisatie van fusie-eiwitten, die kunstmatig de affiniteit van actine binding kan verhogen. Bepaal de eiwitconcentratie door de absorbantie op 280 nm te meten. Verdeel door de uitstootcoëfficiënt; De uitstootcoëfficiënt kan worden berekend uit de eiwitsequentie met behulp van sequentie analyse of online tools. Alternatief, bepaal de eiwitconcentratie met behulp van Bradford of BCA (bicinchoninezuur) methoden. OPMERKING: Voor initiële experimenten is 50-100 μl eiwit bij 20-40 μM gewoonlijk voldoende. Dit zal de analyse van binding in het lage micromolaire bereik mogelijk maken, een bruikbaar uitgangspunt voor de meeste actine-bindende eiwitten. Een grotere quanTijden, en vaak is een hogere eiwitconcentratie nodig om een ​​bindingskromme te genereren om de affiniteit te berekenen (zie rubriek 5). Vlak voor gebruik, draai het eiwit (50.000-100.000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C) om de aggregaten van onoplosbaar eiwit te verwijderen. Als oplosbaarheid een probleem is, meet de eiwitconcentratie opnieuw (stap 2.2) na centrifugeren. 3. Bereid de F-actine voor Verwijder een aliquot van G-actine uit de -80 ° C vriezer en ontdooi het snel. Voeg de 10x polymerisatiebuffer toe aan het G-actine tot een eindconcentratie van 1x. Zorg ervoor dat de G-actin concentratie in 1x polymerisatie buffer ten minste 10-20 μM ligt, ruim boven de kritische concentratie. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT) om het actin te laten polymeriseren. Na polymerisatie bewaart u de F-actine in oplossing bij 4 ° C, waar het enkele weken stabiel blijft. Voordat u de F-actin weer na de opslag gebruikt, moet u omzichtig inverterenOf flip de buis meerdere malen om ervoor te zorgen dat alle actin opgelost en uniform in oplossing worden verdeeld. OPMERKING: (Optioneel) Voeg phalloidine toe om een ​​1: 1 molaire verhouding van G-actine: phalloidine te bereiken. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT zodat de falloidine bindt aan het F-actine. Phalloidin stabiliseert F-actine en verwezenlijkt twee dingen: (i) het vermindert de hoeveelheid actine die niet sedimenteert tijdens centrifugeren en (ii) F-actine verdund kan worden onder de kritische concentratie (~ 0,5 μM), die vaak Noodzakelijk om de hoeveelheid F-actine te veranderen om een ​​bindingscurve te genereren (zie sectie 5 over het meten van de affiniteit). 4. Pelleteringsassay – basisprotocol OPMERKING: Het basisprotocol beschreven in sectie 4 wordt gebruikt om te bepalen of een eiwit van interesse co-sedimenten met F-actine. Zodra de binding aan F-actine is vastgesteld, kan de affiniteit van deze interactie worden gemeten volgens het protocol beschreven in sectie 5. Bereid de reactiebuffer op de gebruiksdag door de 10x voorraad tot 1x te verdunnen en voeg DTT toe aan een uiteindelijke concentratie van 1 mM. OPMERKING: (Optioneel) Voeg polidocanol toe aan een uiteindelijke werkconcentratie van 0,02% in de reactiebuffer. Polidocanol is een oppervlakteactieve stof die niet-specifieke achtergrondbinding vermindert en helpt om te voorkomen dat hydrofobe eiwitten aan de ultracentrifugebuis vallen. Verdun het eiwit van belang voor de gewenste concentraties in 1x reactiebuffer in ultracentrifugebuizen. Houd de monstervolumes laag (40-60 μL) om te vermijden dat grote hoeveelheden eiwitten worden gebruikt door middel van ultracentrifugebuizen met kleine minimumvolumes ( bijv . 7 x 20 mm buizen die elk 0,2 ml bevatten). OPMERKING: Aangezien veel actine-bindende eiwitten een affiniteit hebben voor F-actine in het micromolaire bereik, wordt aanbevolen een eiwit van belang bij 2 en 10 μM te testen. Als binding niet wordt waargenomen bij 10 μM, is het onwaarschijnlijk dat binding bij hogere concentraties wordt waargenomen. Als deToegevoegde eiwitten vormen meer dan 10-20% van het uiteindelijke reactievolume, het kan nodig zijn om het eiwit in de reactiebuffer te dialyseren voordat het experiment wordt uitgevoerd. Voeg F-actine toe aan de gewenste eindconcentratie. OPMERKING: 2 μM is een bruikbare concentratie voor initiële experimenten omdat het goed boven de kritische concentratie ligt, waardoor actine in de filamenteuze toestand wordt gehandhaafd. Het zal een zichtbare pellet produceren wanneer geanalyseerd door SDS-PAGE (stap 4.10). Bereid de volgende controles in ultracentrifugebuizen om de test informatief te maken. Bereiding monster (s) die het eiwit van belang zonder F-actine bevatten. Zorg ervoor dat de concentratie van eiwitten in deze monsters overeenstemt met de concentratie in de plus plus-actin-monsters. OPMERKING: Deze monsters bepalen de hoeveelheid proteïne die in de afwezigheid van F-actine is geaggregeerd of vastzit aan de zijkanten van de ultracentrifugebuis. Bereid negatieve controlemonsters opBij dezelfde of soortgelijke concentratie (en) die gebruikt worden voor het eiwit van belang. Gebruik een controle eiwit dat niet bindt aan F-actine, met en zonder F-actine. OPMERKING: Dit is een belangrijke controle omdat eiwitten in actinfilamenten en pelletjes met F-actine kunnen worden gevangen, hoewel ze F-actine niet binden. De hoeveelheid van de vangst kan variëren afhankelijk van de F-actin bron, buffer omstandigheden, enz. Dus deze controle moet in alle experimenten worden opgenomen. Ideaal gezien zou het controleproteïne een molecuulgewicht hebben dat vergelijkbaar is met het eiwit van belang ( bijv . Voor aE-catenine (~ 100 kDa), BSA (66 kDa) is een geschikte controle). Commercieel verkrijgbare gelfilteringsnormen maken uitstekende controleproteïnen, omdat ze een aantal maten bedekken en de neiging hebben om geen aggregaten te bevatten. Optioneel bereiden positieve controle monsters die een eiwit bevatten dat bindt aan F-actine, met en zonder F-actine. Zorg ervoor dat de concentratie (en) gelijk is aan die van deE eiwit van belang OPMERKING: Deze controle is handig, aangezien het aantoont dat de experimentele condities (bijvoorbeeld bereid F-actine, reactiebuffer en centrifugatie) F-actine binden toestaan. Aangezien de pelleteringsanalyse geen zwakke F-actininteracties kan detecteren (zie de discussie), wordt aanbevolen dat het bekende F-actine bindende eiwit een matige tot zwakke affiniteit heeft voor F-actine ( dwz in het lage micromolaire bereik ). Gezuiverde F-actine bindende eiwitten zijn in de handel verkrijgbaar. Incubeer alle monsters gedurende 30 minuten bij RT. OPMERKING: Langere incubatietijden zijn goed, ervan uitgaande dat het eiwit van belang stabiel is, maar waarschijnlijk onnodig is. Als het eiwit van belang niet bij RT stabiel is, kunnen monsters bij 4 ° C geïncubeerd worden. In dit geval kunnen langere incubatietijden nodig zijn. Laad de monsters in de centrifugrotor. Plaats de buizen binnen de rotor om te helpen bij het resuspenderen van de pellet na centrifugeren.Merk hiervoor alle centrifugebuizen ( bijv. Met een steekproefnummer) en plaats alle buizen in de rotor in dezelfde positie ( bijv. Het nummer naar buiten). Centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 20 minuten bij 4 ° C in een ultracentrifuge. Na centrifugeren, verwijder 3/4 van de supernatant ( bijv . 45 μL indien het startvolume 60 μL) uit elke buis was en meng deze met 1/3 volumes 4x monsterbuffer (15 μL in dit geval) in een aparte microcentrifugebuis. Verwijder de overblijvende supernatant met een gel-laadpunt, let erop dat de pellet niet wordt verstoord (die zichtbaar kan zijn als een glasachtige vlek). OPMERKING: Het is belangrijk om de supernatant zo snel mogelijk na de voltooiing van de centrifuge te verwijderen om de dissociatie na afscheiding van eiwitten te beperken. Was ook de pellet niet met reactiebuffer om dezelfde reden. Voeg 4/3 volumes 1x monsterbuffer toe aan elke pelleT ( bijv . 80 μl indien het startvolume 60 μl was). OPMERKING: Dit maakt de verdunning hetzelfde als voor de supernatant (stap 4.8, 1/3 volumes van 4x monsterbuffer werden toegevoegd), waardoor de directe vergelijking tussen pellet- en supernatantmonsters en de bepaling van het percentage eiwit dat werd gepelleteerd, mogelijk was. Voeg monsterbuffer aan alle buizen toe en incubeer gedurende tenminste 5 minuten bij RT. Laat de pellet in de monsterbuffer zitten om het herstel van het monster te verbeteren. Triturateer het monster 8-10 keer met een p200 pipettip om de pellet te resuspenderen door het pelletgebied van de buis voortdurend te wassen. Scherp de pipettaart voorzichtig over de pellet tijdens de trituratie om te helpen bij resuspensie. OPMERKING: Zorg ervoor dat u tijdens het tritureren geen lucht in de steekproef invoert, aangezien dit de proefbuffer zal bellen en het herstel van het monster zal verminderen. Breng de geresuspendeerde monsters naar microfuge buizen na trituratie. </ Ol> Analyseer de supernatant- en pelletmonsters door SDS-PAGE en Coomassie-kleuring 8 door 10-15 μL monster per baan te laden; Dit is voldoende om de eiwitten te visualiseren. OPMERKING: Proteïnen die co-sedimenten met F-actine zullen verrijkt worden in de "plus F-actin" pelletmonsters over de "nee F-actine" pelletmonsters ( Figuur 1A ). Standaard Coomassie blue staining is voldoende voor detectie als de eiwitconcentraties zich in het 0,1-10 μM bereik bevinden. Colloïdale Coomassie 9 of Western blotting kan gebruikt worden om de gevoeligheid te verhogen als lagere eiwitconcentraties worden gebruikt om interacties met hogere affiniteit te meten. Image Coomassie-gekleurde gels met behulp van een scanner of imaging systeem (stap 5.12). 5. Pelleteringsassay – kwantificering Opmerking: Als specifieke binding aan F-actine wordt waargenomen, kan het nuttig zijn om de affiniteit van t te metenHij interactie. Dit wordt bereikt door een paar wijzigingen en toevoegingen aan het protocol in sectie 4 te maken. Voor een uitstekende gids voor het ontwerpen en interpreteren van bindende analyses, zie Pollard 10 . Een stroomdiagram ( Figuur 2 ) wordt verstrekt voor hulp bij de analyse en kwantificering. Bepaal het concentratiebereik om te testen. OPMERKING: Het concentratiebereik hangt af van het eiwit en moet zich overschrijden van een concentratie onder de schijnbare K d ( bijv. 1 μM) tot concentraties die voldoende zijn om binding te verzadigen. Het is van cruciaal belang dat de binding verzadiging bereikt in meerdere monsters in het hoge einde van het concentratiebereik om een ​​nauwkeurige bindingscurve te genereren ( Figuur 1C ). Zoals hierboven vermeld, hebben veel actine-bindende eiwitten een affiniteit voor F-actine in het lage micromolaire bereik (1-5 μM). Voor een eiwit met een Kd van 0,5-1 μM zou een bruikbaar uitgangsconcentratiebereik 0,1-1 zijn0 μM. Hard spin (stap 2.3) het eiwit van belang om aggregaten te verwijderen. Verdun het eiwit serieel om een ​​concentratieserie te maken die 7-8 monsters bevat bij 2x de te testen eindconcentratie. Als bijvoorbeeld het bereik om te testen 0,1-8 uM is, bereidt u de volgende verdunningen op in 1x reactiebuffer: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 en 0,2 μM. OPMERKING: Als het toegevoegde eiwit meer dan 10% -20% van de eerste verdunning (het 16 μM monster in het bovenstaande voorbeeld) bevat, kan het nodig zijn om het eiwit verder te concentreren of de dialyse te dialyseren Eiwit in 1x reactiebuffer. Zorg ervoor dat u genoeg van elke verdunning voor "plus F-actine" en "geen F-actine" monsters voorbereidt. Bereiding van monsters (zoals in sectie 4), door het eiwit van belang te verwennen tot de gewenste concentraties in 1x reactiebuffer in ultracentrifugebuizen. Houd de monstervolumes laag (40-60 μL) om te vermijden dat u grote hoeveelheden eiwit gebruikt door ultracentraal te gebruikenRifuge buizen met kleine minimumvolumes ( bijv . 7 x 20 mm buizen die elk 0,2 ml bevatten). Voeg F-actine toe aan de gewenste eindconcentratie op de juiste monsters en breng het volume op met 1x reactiebuffer. Bijvoorbeeld, voor 50 μl reacties met 2 μM F-actine, zorg ervoor dat elk monster 25 μL 2x eiwit, 10 μl 10 μM F-actine en 15 μl 1x reactiebuffer heeft. Inclusief controlemonsters (stappen 4.4.2 en 4.4.3). OPMERKING: Voor negatieve en positieve controles gebruik één concentratie binnen het te testen bereik (stap 5.1), ideaal in de buurt van het midden tot het hoge uiteinde van het bereik ( bijv. 4 μM indien het concentratiebereik 0,1-10 μM is). Incubeer alle monsters gedurende 30 minuten bij RT. Na 30 minuten verwijder 1/5 van elk monster ( bijv. 10 μL van de 50 μL reactie) en meng met 20 μl water en 10 μl 4x monsterbuffer. OPMERKING: dit zijn de "Totaal" sAmples en wordt gebruikt om een ​​standaardkromme te genereren. Laad de monsters in de ultracentrifuge rotor. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 100.000 xg en 4 ° C. Optioneel, na centrifugering, verwijder 3/4 van de supernatant ( bijv. 30 μL als het gecentrifugeerde volume 40 μL) uit elke buis was en meng deze met 4x monsterbuffer (10 μL in dit geval) in een aparte microfuge buis. Verwijder de overblijvende supernatant met een gel-laadpunt, let erop dat de pellet niet wordt verstoord. OPMERKING: Bij het meten van de bindingsaffiniteit hoeft het supernatant niet te worden uitgevoerd. Niettemin kan het nuttig zijn om de supernatant op te slaan, vooral bij het testen van een nieuw eiwit. Verwijder de supernatant indien niet analyseren (stap 5.7). Resuspendeer de pellet in 1 volume van 1x monsterbuffer ( bijv. 40 μl indien het gecentrifugeerde volume 40 μl was). Voeg monsterbuffer aan alle buizen toe en incubeer gedurende tenminste 5 minuten bij RT. TrReinig het monster 8-10 keer met een p200 pipettip, wasser het pelletgebied van de buis voortdurend. Scherp de pipettaart voorzichtig over de pellet tijdens de trituratie om te helpen bij resuspensie. Breng het geresuspendeerde eiwit over naar een microcentrifugebuis. OPMERKING: dit zijn de "Pellet" monsters. Analyseer de Total en Pellet-monsters door SDS-PAGE 8 . Voer alle monsters op één gel, indien mogelijk; Indien niet, laat de pelletmonsters op een gel en de totale monsters op een seconde lopen. OPMERKING: Gezien het aantal monsters, wordt een groot gel systeem aanbevolen voor analyse. Als monsters worden uitgevoerd op twee of meer gels, is het belangrijk dat alle gels identiek zijn ( dwz dezelfde Coomassie-oplossing en een identieke tijd in vlek / afbraak). Image Coomassie-gekleurde gels met behulp van een beeldvormingssysteem dat de eiwitbandintensiteiten meet over een breed ( dwz een twee tot drie log) en lineair bereik. Zorg ervoor dat de afbeeldingen aOpnieuw verzameld zonder verzadigde pixels. OPMERKING: Lasergebaseerde beeldsystemen bieden de beste gevoeligheids- en signaal-geluidsverhoudingen. Met behulp van ImageJ of een vergelijkbaar analyse programma, meet de intensiteit van eiwitband en bereken de hoeveelheid gebonden eiwit. OPMERKING: Gebruik voor alle voorbeeldmetingen het selectievakje in ImageJ om een ​​regio van interesse (ROI) rond elke band te tekenen en meet (Analyse> Meet) het gebied en gemiddelde grijze waarde. Bereken de achtergrond voor elke gel door de gemiddelde grijze waarde van een gebied zonder monster te meten. Trek de achtergrondgemiddelde grijze waarde van elke ROI gemiddelde grijze waarde af en vermenigvuldig vervolgens met het gebied om de geïntegreerde dichtheidswaarde voor elke band te verkrijgen. Meet het eiwit van belangsterkte intensiteiten van de totale monsters ( figuur 2A ). Genereer een standaardkromme door de bandintensiteit ( dwz de geïntegreerde dichtheidsmetingen) tegen eiwitmassa te plotten ( Figuur2B). Meet de hoeveelheid eiwit van belang die co-sedimenteert met F-actine (co-sedimented protein, Figuur 2C ). Meet de hoeveelheid eiwit van belang die in de afwezigheid van F-actine (achtergrond sedimentatie, Figuur 2D ) sedimenteert. Trek de achtergrond sedimentatie af van het co-sedimentatie eiwit ( dwz trek de waarden van stap 5.13.4 af van stap 5.13.3) om de hoeveelheid eiwit die gebonden is aan F-actine te bepalen. Meet de hoeveelheid F-actine in elke pellet ( Figuur 2E ). Bepaal de gemiddelde hoeveelheid F-actine per monster en verdeel dan elk monster met het gemiddelde om de verhouding van F-actine in elk monster te bepalen ten opzichte van het gemiddelde ( dwz de getallen onder de banden). Voor elk monster verdeel de hoeveelheid gebonden proteïne (berekend in stap 5.13.5) door de F-actin actin-pelletverhouding (stap 5.13.6) om in te stellen voor verschillen in de pellet. NOTE: Deze waarde is het genormaliseerde gebonden eiwit. Gebruik de standaardkromme (stap 5.13.2) om de hoeveelheid (massa) van genormaliseerd gebonden eiwit (stap 5.13.7) in elk monster te berekenen. OPMERKING: Het eiwit dat oorspronkelijk is verwijderd (het "totaal" monster), evenals het geladen hoeveelheid (dat, tenzij de volledige pellet geladen is, een deel van de pellet zal zijn) moet worden verantwoord bij het berekenen van de totale hoeveelheid eiwit Dat pelleteerde. Bepaal de concentratie van gebonden eiwit in elk monster uit de totale massa eiwit in de pellet (berekend in stap 5.13.8) en het volume van het monster. Trek deze waarde af van de startconcentratie om de hoeveelheid vrij eiwit te bepalen. Verdeel de concentratie van gebonden eiwit door de concentratie van actine (μM / μM actin) en plot versus de concentratie van vrij eiwit om een ​​bindingscurve te genereren ( Figuur 1C ). OPMERKING: Aangezien F-actine geen enkele, uniforme soort is, is het moeilijkCultus om de molaire concentratie van F-actine uit de G-actin concentratie te extrapoleren. Gebruik de start G-actin concentratie om de hoeveelheid gebonden eiwit (μM / μM actin) te bepalen en schat de schijnbare concentratie van bindingsplaatsen in de reactie te bepalen. De concentratie van bindingsplaatsen is gewoonlijk minder dan de concentratie van actine monomeren in de reactie omdat niet alle actine polymeriseert en omdat een enkel actine bindend eiwit molecuul contact kan maken met meerdere monomeren op het actine filament. Met behulp van een statistisch programma bepaalt u de affiniteit (Kd) en Bmax van de bindingscurve door gebruik te maken van nonlinear least squares regressie. OPMERKING: Scatchard plots worden ontmoedigd voor het analyseren van bindende gegevens, mede omdat ze kunnen verduisteren of binding verzadigd is en omdat ze experimentele fout 10 kunnen vervalsen.