Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

Amanda L. Karam; Catherine C. McMillan; Yi-Chun Lai; Francis L. de los Reyes III; Heike W. Sederoff; Amy M. Grunden; Ranji S. Ranjithan; James W. Levis; Joel J. Ducoste

doi:10.3791/55545

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioengineering

Строительство и настройка сканирующего фотосинтетического биореактора водорослей с контролем температуры, света и pH для испытаний на кинетический рост

Published: June 14, 2017

doi:

10.3791/55545

Amanda L. Karam¹, Catherine C. McMillan¹, Yi-Chun Lai¹, Francis L. de los Reyes III¹, Heike W. Sederoff², Amy M. Grunden², Ranji S. Ranjithan¹, James W. Levis¹, Joel J. Ducoste¹

¹Department of Civil, Construction, and Environmental Engineering,North Carolina State University, ²Department of Plant and Microbial Biology,North Carolina State University

Summary

В этой статье описывается процесс сборки и работы сканирующего фотосинтетического биореактора, который может использоваться совместно с другими методами для оценки соответствующих параметров кинетического роста. Эта система постоянно контролирует pH, свет и температуру с помощью датчиков, блока сбора данных и управления и программного обеспечения для сбора данных с открытым исходным кодом.

Abstract

Оптимальная конструкция и работа фотосинтетических биореакторов (PBR) для культивирования микроводорослей необходимы для улучшения экологической и экономической эффективности производства биотоплива на основе микроводорослей. Модели, которые оценивают рост микрогалактики в разных условиях, могут помочь оптимизировать дизайн и работу PBR. Чтобы быть эффективными, параметры роста, используемые в этих моделях, должны быть точно определены. Эксперименты по выращиванию водорослей часто ограничиваются динамическим характером среды культуры, и для точного определения кинетических параметров необходимы системы управления. Первым шагом в настройке контролируемого пакетного эксперимента является сбор и мониторинг живых данных. В этом протоколе описывается процесс сборки и работы сканирующего фотосинтетического биореактора, который можно использовать для проведения экспериментов по выращиванию микрогалактик. В этом протоколе описывается, как определять размер и собирать планшетный PBR с акриловым покрытием. В нем также описывается, как настроитьRe PBR с непрерывным контролем pH, света и температуры с использованием блока сбора и управления данными, аналоговых датчиков и программного обеспечения для сбора данных с открытым исходным кодом.

Introduction

Из-за растущей озабоченности по поводу глобального изменения климата и конечных ресурсов ископаемого топлива правительства разрабатывают политику сокращения потребления ископаемого топлива и поощряют разработку новых устойчивых транспортных топлив. Агентство по охране окружающей среды Соединенных Штатов разработало стандарт возобновляемого топлива (RFS), в соответствии с которым к 2022 году из возобновляемых источников топлива будет приходиться 36 из 140 миллиардов галлонов американской топливной смеси. Источники и трансформационные технологии будут необходимы для удовлетворения этих и Будущие стандарты в области возобновляемых источников энергии ¹ .

Использование биотоплива на основе микроводорослей может помочь удовлетворить национальные RFS при одновременном снижении выбросов парниковых газов ² . Биотопливо на основе микроводорослей имеет несколько преимуществ по сравнению с биотопливом первого поколения на основе наземных продовольственных культур, таких как кукуруза и соевые бобы. В отличие от биотоплива первого поколения, водоросли-bПоскольку биотопливо потребляет меньше земли, воды и связанных с продовольствием ресурсов, поскольку водоросли можно выращивать круглый год и на бесплодных землях с использованием соленой воды или сточных вод. Микроводоросли имеют высокие темпы роста по сравнению с наземными культурами и могут накапливать высокие уровни липидов, которые могут быть легко преобразованы в биодизель ³ . В настоящее время не существует промышленных установок для производства водорослей и биотоплива из-за высоких издержек энергоемких производственных процессов, которые состоят из культивирования водорослей, разделения липидов и переработки липидов в биодизель. Необходимы дополнительные исследования, чтобы сделать эти процессы более эффективными и устойчивыми.

PBR, которые являются оптически прозрачными закрытыми установками для производства фототрофных микроорганизмов в искусственной среде, считаются одним из наиболее перспективных методов культивации ³ . Тем не менее, в нынешних конструкциях по-прежнему отсутствует объемная производительность, необходимая для производства процесса производства водорослей и биотопливаБолее эффективны и экономически привлекательны ⁴ . Мощные математические модели, которые учитывают световую освещенность и затухание, транспортировку питательных веществ и CO ₂ , а также рост микроводорослей, могут значительно облегчить оптимизацию конструкции и работы PBR. Для определения видоспецифических параметров роста для этих моделей оптимизации требуются эксперименты по наращиванию скамьи.

Кинетические испытания требуют тщательного мониторинга и контроля экспериментальных установок для предотвращения непреднамеренных ингибиторов роста. Учитывая фотосинтетический характер водорослей ( т. Е. Их потребление CO ₂ и поглощение света), поддержание контролируемых условий особенно затруднено в настольных PBR. Как показано в уравнении 1 , количество растворенного СО ₂ в ростовой среде, обычно обозначаемое как ( Уравнение 2 ), будет, как минимум,Функция: 1) парциального давления CO ₂ и константы равновесия Генри, которая определяет количество газа, которое растворяется в растворе ( уравнение 3 ); 2) начальный химический состав среды роста, который влияет на видообразование и активность ионов карбоната и рН ( уравнения 4 и 5 ); И 3) температура, которая воздействует на уравнения 3-5 ⁵ .

Различные фазы и химическое образование углерода создают проблему для измерения и поддержания постоянной концентрации растворенного углерода в пределах PBR, которыйLe, сохраняя другие условия постоянными ( например, pH увеличивается, поскольку водоросли потребляют CO ₂ , а увеличение растворенного субстрата CO ₂ может привести к кислой среде, которая препятствует росту).

Дополнительный уровень сложности для контроля условий во время кинетических испытаний водорослей включает интенсивность света внутри PBR. Средняя интенсивность света внутри PBR зависит не только от интенсивности падающего света, но и от конструкции ( например, материала, формы, глубины и смешивания), абсорбции компонентов биомассы водорослей (особенно хлорофилла) Рассеивающие свойства водорослевых клеток. По мере роста водорослей средняя интенсивность света будет уменьшаться. Это изменение интенсивности света, вызванное увеличением общих клеток и биомассы, увеличением содержания хлорофилла на клетку или и тем, и другим, может в конечном итоге вызвать метаболический ответ, такой как увеличение производства хлорофиллаНа клетку или использование продуктов для хранения углеводов и липидов для энергии ⁷ . Непосредственный мониторинг интенсивности света внутри реактора дает бесценную информацию. Эти данные могут помочь обеспечить сохранение условий в пределах определенного диапазона и могут быть использованы для оценки параметров роста водорослей и абсорбции в сочетании с другими измерениями ( например, биомасса, концентрация хлорофилла, глубина реактора, падающий свет и т . Д.).

Понимание того, как растут водоросли в определенных условиях, требует, чтобы в экспериментальных кинетических экспериментах контролировались рН, растворенный СО ₂ , интенсивность света и температура. Многие установки роста водорослей не оборудованы для мониторинга условий в объеме, необходимом для калибровки кинетических моделей, что делает процесс моделирования чрезвычайно сложным ⁸ . Несмотря на то, что многие компании предлагают комплексные PBR с автоматизацией и контролем, эти сканерыЕ настройки могут быть чрезвычайно дорогими (~ 20 000 долларов США) и могут не учитывать все экспериментальные соображения данного исследовательского вопроса.

Первым шагом в создании системы обратной связи для пакетного эксперимента является сбор данных в реальном времени. Настоящая статья призвана продемонстрировать, как построить и настроить настольную PBR, оборудованную непрерывным светом, pH и контролем температуры. Эта настройка мониторинга в реальном времени может помочь обеспечить условия эксперимента в пределах желаемого диапазона, по усмотрению исследователя. Хотя этот протокол не описывает конкретные механизмы управления, эти пошаговые инструкции обеспечивают базовую основу для структуры сбора данных, требуемой до того, как могут быть реализованы более сложные контрольные обратные связи.

Protocol

1. Построить корпус и крышку PBR ПРИМЕЧАНИЕ. Для иллюстрации Dunaliella sp. , В качестве модельного организма для построения этого PBR использовали галотолерантные микроводоросли размером 10 мкм с отсутствием клеточной стенки. Определите объем PBR, необходимый для исследований. Определите экспериментальные цели для этой PBR. Определите, какие анализы измерения водорослей, M , необходимы для характеристики роста интересующих видов водорослей, включая объем, необходимый для анализа, v ; Количество технических реплик, n ; Частота дискретизации, f ; И продолжительность экспериментов t . ПРИМЕЧАНИЕ. Специфические для проекта вопросы исследования, виды водорослей и доступное оборудование диктуют измеряемые свойства водорослей, методы, используемые для этих измерений, и частоту этих измерений. Биомасса; Количество клеток; И всегоХлорофилловый пигмент, белок, липид, углевод и внешние измерения концентрации нитратов являются общими способами оценки роста, а ежедневный отбор проб в течение 5-14 дней является общим подходом к испытаниям на рост 9 , 10 . Вычислите общий объем культивирования V s , необходимый для отбора проб в течение одного эксперимента с использованием уравнения 6 . Используйте уравнение 7 для оценки целевого объема PBR, V p , используя V s с шага 1.1.3 и фракцию удаления максимального объема, F. ПРИМЕЧАНИЕ. Удаление менее заданной доли общего объема культуры ( например, ~ 20%) может помочь обеспечить, чтобы условия внутри PBR, т. Е. (Мощность смешивания, распределение света и т. Д.), Не были drasticaВо время эксперимента изменяется по мере того, как объем культуры удаляется. Предполагая 10-дневный эксперимент, где биомасса; Количество клеток; И общие концентрации хлорофилла, белка, липидов, углеводов и нитратов измеряются ежедневно в трех экземплярах, используют общий объем выборки ~ 600 мл. Если вы хотите удалить не более 18,75% от общего объема культуры, используйте общий объем рабочего реактора не менее 3,2 л. Выберите датчики и аксессуары для экспериментов PBR. Выберите датчики pH, света и температуры для непрерывного мониторинга. ПРИМЕЧАНИЕ. Датчики должны быть совместимы с блоком сбора данных и должны выдерживать условия внутренней культуры ( например, диапазон рН, свет, тепло, мусор, соль и т . Д.). Здесь выбраны нержавеющие и солеустойчивые зонды, так как Dunaliella sp. Морские микроводоросли. Выберите конструкцию рабочего колеса и двигатель, чтобы удовлетворитьТребования к перемешиванию. ПРИМЕЧАНИЕ. Например, осевое рабочее колесо с низким сдвигом является хорошим выбором для водорослей Dunaliella, поскольку они не имеют клеточной стенки и могут легко срезать 11 . Эти водоросли имеют жгутистую локомоцию и не нуждаются в интенсивном перемешивании 11 . Низкие скорости смешивания могут быть достигнуты с помощью мини-редуктора 12 В. Рабочее колесо и вал могут быть трехмерными (информация о трехмерной печати может быть найдена в списке материалов). Соберите корпус и крышку PBR. Определите размеры реактора на основе расчетов объема на шаге 1.1, имея в виду экспериментальные цели и потенциальные ограничения ( например, пространство). ПРИМЕЧАНИЕ. Предпочтительной является конструкция PBR с более низким отношением поверхности к объему, так как эта форма минимизирует ослабление света во всем PBR, обеспечивая более последовательное распределение света на протяжении всего эксперимента. Вырезать пять частей оптически прозрачного литьяАкриловые листы (~ 0,25-0,5 дюйма) с использованием настольной пилы в соответствии с конструкцией PBR и размером, установленным на шаге 1.3.1. Убедитесь, что стыковые края сглажены, но не закруглены, используя наждачную бумагу от 200 до 400. Закрепите края акриловых деталей вместе с лентой и / или зажимами. ПРИМЕЧАНИЕ. Акриловый цемент не является клеем. Если поверхности акрилового склеивания являются грубыми или акриловые кусочки не равномерно выровнены, этот цемент для склеивания не будет эффективен. В хорошо проветриваемом помещении нанесите акриловый цемент вдоль суставов, используя дозатор игл. Пластиковые поверхности сразу же будут сцеплены. Позвольте кускам сидеть в течение 24 часов. ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ. Следует использовать маску и перчатки, чтобы избежать ингаляции и воздействия на кожу при использовании акрилового цемента. Нанесите вязкий акриловый цемент на суставы, чтобы гарантировать, что PBR является водонепроницаемым. Оставьте цемент сушить в течение 24-48 часов, в соответствии с инструкциями по цементу; Время сушки может меняться. ЗаполнитеРеактор с водой для проверки видимых утечек. Если нет утечек, поместите реактор на бумажные полотенца и повторите проверку на наличие признаков утечки через 24-36 часов. ПРИМЕЧАНИЕ. Для сборки PBR, содержащих более ~ 2 л, следует использовать акриловые листы толщиной не менее ~ 0,5 дюйма; Более тонкие листы могут наклоняться под давлением воды и вызывать утечки. Прокладки и повторно применяемые винты могут использоваться в качестве более надежной альтернативы акриловому цементу ( рис. 1 ). Этот тип сборки требует прецизионного оборудования и должен выполняться чрезвычайно осторожно, так как акрил может легко трескаться. Используйте механический цех для проектирования крышки PBR, с портами для размещения датчиков и других принадлежностей и потребностей PBR ( т. Е. Крыльчаткой, газопроводами, пробоотборными портами и т. Д.). Убедитесь, что внутренние компоненты не мешают друг другу. ПРИМЕЧАНИЕ. Конфигурация / конструкция крышки PBR и PBR будет зависеть от аксессуаров реактора и экспериментальных целей. См . Рис. 1Для примера реактора PBR и конструкции крышки (дополнительную информацию можно найти в разделе материалов). Эта схема PBR будет указана для остальной части протокола. Рисунок 1: Изображение индивидуальной настройки PBR шкалы с датчиками и микшером. Эта настройка показывает смеситель, электрод, прикрепленный к крышке через резьбовой порт в крышке, и датчик освещенности, прикрепленный к специально разработанной крышке. Эта конструкция крышки также включает в себя крепление мини-редуктора 12 В постоянного тока. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 2. Настройка и настройка датчиков с помощью блока сбора данных и управления ПРИМЕЧАНИЕ. Датчики переводят изменения вФизический мир в измеримый аналоговый сигнал, часто напряжение. Блоки сбора данных служат интерфейсом между цифровым и физическим миром и могут использоваться для считывания этих аналоговых сигналов и преобразования их в дискретные значения, как указано компьютером. Модуль описания данных, описанный здесь, имеет разрешение аналогового входа 16 бит, может считывать до 14 аналоговых сигналов (± 10 В) и может подавать питание, требуемое некоторыми датчиками (до 5 В). Эти инструкции содержат обзор того, как настроить этот блок сбора данных и управления, чтобы преобразовать аналоговый сигнал в более значимые значения для света, рН и температуры в пределах PBR. Эти инструкции не содержат подробных важных понятий ( т . Е. Квантования, точности, времени отклика и т . Д.), Необходимых для полной интерпретации этих измеренных значений и количественной оценки неопределенности. <br/> Рисунок 2: Схема подключения датчиков и данных. На этой диаграмме показано, как настроить датчики pH, света и температуры на блок сбора данных и управления, используемый для этого протокола. Показаны компоненты обработки сигналов для датчика pH и освещенности. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Установите и настройте датчик освещенности с помощью блока сбора данных и управления с помощью фильтра нижних частот. ПРИМЕЧАНИЕ. См. Рисунок 2 для общих эталонных диаграмм. Спецификации датчика производителя указывают разницу между сигналом, мощностью и проводами заземления на основе цвета. Низкочастотный фильтр представляет собой простую схему, в которой используется резистор и конденсатор для фильтрации нежелательных шумов от электрических сигналов. Этот тип фильтра ослабляет электрические сигналы с более высокими частотамиN частота среза, определяемая сопротивлением и емкостью. Этот фильтр помогает удалить или сгладить электрический шум от сигнала датчика. Используя проволочные стрипперы, отрежьте кусок зеленого соединителя на 2 дюйма; Полосу 0,25 дюйма изоляции от одного конца и ~ 0,5 дюйма от другого конца обеих частей. Определите провод аналогового сигнала на датчике освещенности. Убедитесь, что по меньшей мере ~ 0,25-0,50 дюйма металлической проволоки открыта после изоляции провода. Тщательно обмотайте одну ногу резистора 1000 Ом вокруг утолщенного конца соединительного провода на 0,5 дюйма. Оберните другую ногу резистора вокруг открытой секции аналогового сигнального провода датчика освещенности. Используйте паяльник и бессвинцовый припой, чтобы припаять резисторные ножки к проводу. Дайте припою остыть в течение 2-5 минут. ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Припой и паяльники становятся очень горячими и могут быть очень опасными, если пользователи не обучены должным образом. Учебные видеоролики можно найти в Интернете, Защитные очки и другие меры предосторожности чрезвычайно важны. Во время этого процесса провода не должны быть подключены к источнику питания или другим устройствам. Слейте 1,5-дюймовую часть термоусадочной трубки на один конец соединительной проволоки и сдвиньте ее до тех пор, пока она не закроет паяный провод и резистор. Убедитесь, что все металлические части полностью закрыты. Термоусадка с использованием теплового пистолета. Удостоверьтесь, что трубка обертывается вокруг резистора и проводов; Ни один оголенный провод не должен подвергаться воздействию. Прикрепите провод заземления датчика освещенности к клемме свободного заземления (GND) на блоке сбора данных и управления с помощью отвертки. Закрепите свободный конец провода разъема сигнала на клемме свободного аналогового входа (AIN) с помощью отвертки. Закрепите положительный вывод конденсатора емкостью 1000 мкФ ( т.е. более длинную ногу) на том же терминале AIN, что и на шаге 2.1.8, и отрицательный вывод ( т. Е. Более короткая нога) на тот же терминал GND, что и на шаге 2.1.7.Убедитесь, что и конец конденсатора, и провод прочно соединены с клеммой. Определите провод питания для датчика освещенности и закрепите этот провод на клемме источника питания (VS) на блоке сбора данных и управления. Настройте и сконфигурируйте pH-электрод с помощью блока сбора данных с использованием усилителя с одним усилителем и фильтра нижних частот. ПРИМЕЧАНИЕ . Из-за природы измерений pH ( т . Е. Высокого импеданса и низкого напряжения) часто требуется усиливающий буфер с единичным усилением между зондом pH и устройством для сбора данных. Фильтр нижних частот также полезен для измерения рН, чтобы защитить сигнал от окружающих электрических шумов. Подключите усилитель с единичным коэффициентом усиления к датчику pH с помощью провода передатчика. Подключите коаксиальный адаптер с положительными и отрицательными клеммами порта к другому концу усилителя с единичным усилением. Вырежьте два 6-кусочков зеленого и 1 ~ 12-дюймового piecE черного соединительного провода с помощью съемников. Газа – 0,25 дюйма изоляции на обоих концах черного соединительного провода. Газа – 0,25 дюйма и ~ 0,5 дюйма изоляции от концов зеленых соединительных проводов с помощью стриптизершей. Тщательно обмотайте одну ногу резистора 1000 Ом вокруг отсека размером ~ 0,5 дюйма одного зеленого соединительного провода. Обмотайте другую резисторную ногу вокруг отсека размером 0,5 дюйма другого зеленого соединителя. Используйте паяльник и бессвинцовый припой, чтобы припаять резисторные ножки к проводу. Дайте припою остыть в течение 2-5 минут. Слейте 1,5-дюймовую часть термоусадочной трубки на один конец соединительной проволоки и сдвиньте ее до тех пор, пока она не закроет паяный провод и резистор. Убедитесь, что все металлические части полностью закрыты. Термоусадка с использованием теплового пистолета. Убедитесь, что пластиковые обертывания плотно облегают резистор и провода; Ни один оголенный провод не должен подвергаться воздействию. Закрепите один конец черного cOnnector к отрицательной (черной) клемме на коаксиальном адаптере. Вставьте другой конец этого провода в GND-терминал блока сбора и управления данными и закрепите его с помощью отвертки. Закрепите один конец зеленого соединительного провода (последовательно с резистором) до положительной (красной) клеммы на коаксиальном адаптере. Вставьте другой конец этого соединительного провода в свободный терминал AIN на блоке сбора данных и управления. Определите положительный вывод конденсатора емкостью 1000 мкФ ( т. Е. Более длинную ногу) и закрепите его на одном и том же терминале AIN, как на этапе 2.2.9; Убедитесь, что и конец конденсатора, и сигнальный провод прочно соединены с клеммой. Закрепите отрицательный вывод конденсатора емкостью 1000 мкФ ( т.е. более короткую ногу) на том же терминале GND, что и на шаге 2.2.8. Подключите датчик температуры к блоку сбора и управления данными, подключив сигнал, землю и мощность wЗонд зонда для освобождения клемм AIN, GND и VS. 3. Настройте Live Data Acquisition и экспериментальный файл ПРИМЕЧАНИЕ. Программное обеспечение для сбора и управления данными, описанное здесь, связывается с блоком сбора данных и управления для мониторинга и регистрации данных датчика с заданными пользователем временными интервалами. В приведенных ниже инструкциях объясняется, как настроить файл управления в этом программном обеспечении для мониторинга и регистрации значений pH, температуры и света. Эти инструкции специфичны для программного обеспечения и блока сбора и управления данными, перечисленных в разделе материалов. Дальнейшие инструкции можно найти в руководствах пользователя. Подключите блок сбора данных и управления к компьютеру рядом с экспериментальной установкой с помощью USB-кабеля и загрузите все необходимые драйверы. Загрузите и откройте программное обеспечение для сбора и управления данными. Настройте «Конверсии» для каждого датчика в программном обеспечении. ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы преобразовать физическое напряжениеВозрастного сигнала в значащее значение, должен применяться некоторый коэффициент преобразования, установленный путем калибровки. Многие датчики поставляются с заводскими параметрами калибровки, указанными в спецификационных листах, соответствующих конкретным продуктам. Уравнения конверсии относятся к настройке и датчикам. Многие параметры уравнения преобразования, особенно для электродов, должны регулярно обновляться с помощью калибровки. Время жизни датчика и частота калибровки будут зависеть от спецификаций продукта и рабочей среды. ПРИМЕЧАНИЕ. Пользователи должны полностью и полностью прочитать эти спецификации. В таблице 1 показаны конверсии для датчиков, найденных в списке материалов. Ниже приведен пример преобразования температурного зонда. Перейдите к разделу «Конверсии» в рабочей области программного обеспечения в правой части главной страницы. Добавьте имя конверсии, например «volts_to_celsius», и введите уравнение преобразования: ( значение 55,56 x ) + 255,37 – 273,15. Название канала Название конверсии Уравнение Заметки температура volts_to_celsius (55,56 х) + 255,37 – 273,15 Уравнение преобразования производителя для преобразования вольт в цель. Легкий volts_to_PPFD Значение x 500 Коэффициент преобразования производителя для преобразования вольт в плотность фотосинтетического фотонного потока (мкмоль м -2 с -1 ), производитель светодиодной коррекции не применяется. pH volts_to_pH (-17,05 х) + 6,93 Калибровочное уравнение преобразования (рис. 4b) для преобразования показаний напряжения pH электрода в значения pH. Используйте только переход на pH-канал aКалибровка. Таблица 1: Таблица преобразования каналов для файла сбора данных. Примеры того, как вводить информацию о канале и преобразовании для датчиков в программное обеспечение для сбора данных. Настройте соответствующие каналы для каждого датчика в программном обеспечении для получения данных датчиков. ПРИМЕЧАНИЕ. Каждый датчик нуждается в собственном аналого-цифровом канале в программном обеспечении и назначенной аналоговой входной клемме в блоке сбора данных и управления. Перейдите на страницу «Канал» в программном обеспечении. Добавьте имя канала датчика. Символы пробела не допускаются. Выберите соответствующее устройство для сбора данных для соответствующего канала; Это устройство будет соответствовать устройству для получения данных. Введите номер устройства, используемый для ссылки на блок сбора и управления данными или другойУстройство для сбора данных; Если используется только один блок, номер по умолчанию часто равен нулю. Выберите аналого-цифровой «от A до D» для типа ввода-вывода («Тип ввода / вывода») и введите номер канала, который соответствует номеру терминала AIN на блоке сбора и управления данными Введите желаемую выборку «Сроки» (ы); Это значение указывает, как часто будет считываться сигнал датчика. Введите 1.0, чтобы получить чтение каждые 1 с. Чтобы усреднить данные за 1-минутный интервал перед регистрацией, установите флажок «Среднее» и укажите 60 для длины усреднения. Выберите подходящее преобразование из раскрывающегося меню, если это применимо (см. Шаг 3.3 для создания конверсий); В противном случае все данные канала будут отображаться / записываться как напряжение. Настройте «Logging Set» для регистрации экспериментальных данных. Перейдите в «Панель ведения журнала» в рабочей области программного обеспечения, добавьтеEw, и соответствующим образом назовите набор. Выберите тип и местоположение выходного файла; Тип файла ASCII предоставит файл значений, разделенный запятыми, если в имени выходного файла указано расширение .csv. Добавьте все необходимые каналы для входа в этот набор. Запуск и остановка ведения журнала по желанию, щелкнув правой кнопкой мыши последовательность ведения журнала в рабочей области и выбрав соответствующую опцию. ПРИМЕЧАНИЕ. Не пытайтесь получить доступ к файлу при активном протоколировании данных. Это действие может нарушить процесс ведения журнала. Местоположение файла для постоянно зарегистрированных файлов не должно быть сохранено / записано в каталоге облака. Настройте страницу «Страница», чтобы отобразить данные и графики. Перейдите к экрану «Страницы» в рабочей области программного обеспечения. Нажмите на одну из пустых страниц по умолчанию. Чтобы отобразить число выходных данных датчика на странице, добавьте на страницу значение «Variable Value». установкаHt-click в любом месте на пустой странице, выберите «Дисплеи» и нажмите «Переменная стоимость»; На экране появится маленькая рамка. Щелкните правой кнопкой мыши на этом недавно созданном окне и выберите «Свойства». Введите заголовок дисплея (например, «Температура в реакторе»), ссылку на канал (например, «Температура [0]») и соответствующие единицы измерения (например, «Цельсия»). Нажмите «ОК» и вернитесь на страницу отображения. Чтобы отобразить данные датчика графически и в реальном времени, добавьте 2D-график на страницу отображения. Щелкните правой кнопкой мыши в любом месте пустой страницы и выберите «Графы», а затем «2-D графики»; На экране появится небольшой сюжет. Щелкните правой кнопкой мыши только что созданный график и выберите «Свойства». На вкладке «Трассы» введите нужное имя канала датчика (например, «Температура») в поле «Y Expression:» и убедитесь, что «Время» является строкойN в поле «X Expression :.» Нажмите «ОК» и вернитесь на страницу отображения. 4. Откалибруйте pH-зонд ПРИМЕЧАНИЕ. Калибровку pH необходимо выполнять перед каждым экспериментом, при предполагаемой температуре эксперимента, и соответственно необходимо обновлять преобразования pH- канала. Показатели рН электрода могут дрейфовать во время экспериментов; Для определения степени этого дрейфа, повторите процесс калибровки после запуска экспериментальной установки и сравните показания. PH-электроды должны храниться надлежащим образом в соответствующем хранилище до и после экспериментов, как указано изготовителем. Подключите датчики pH и температуры, как описано на шаге 2. Вставьте pH-электрод и температурный зонд в буфер 7 для калибровки pH. Проверьте графический дисплей, чтобы убедиться, что показания температуры зонда находятся на желаемой температуреДля проведения экспериментов (шаг 3.6.2.2). Разрешить стабилизацию напряжения электрода pH ( т. Е. Показания напряжения больше не меняются в одном направлении). Для подтверждения стабилизации используйте графический дисплей. Загрузите данные о температуре и pH в файл (шаг 3.5) в течение 30-60 с. Во время этого процесса канал pH не должен иметь никаких преобразований или включать какое-либо усреднение. Примечание. Поскольку pH-электроды чувствительны к электрическим шумам, может быть предпочтительнее более низкая синхронизация (т.е. более быстрая выборка) для канала pH ( например, «Timing» = 0,1 с). Имейте в виду, что для более низкого времени потребуется больше вычислительных ресурсов. Повторите калибровку для буферов 4 и 10. Убедитесь, что отклик датчика находится между -57 и -59 мВ / рН ( рис. 3а ). Создайте уравнение преобразования, построив значение буфера pH по сравнению с напряжением и установив линию ( рисунок 3b </strong >). Обновите уравнение преобразования, как описано в шаге 3.3. Примените это преобразование к каналу pH и обновите настройки канала, чтобы включить усреднение по желанию для ведения журнала. 5. Настройте PBR для Algal Experiment ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие шаги относятся к Dunaliella и индивидуальному PBR, показанному на рисунке 1 . Более того, эти инструкции по установке не соответствуют стерильным протоколам, так как эта система не была сконструирована таким образом. Подготовьте инокулят водорослей и среду для роста, как это необходимо для эксперимента и целей эксперимента. Подключите провода pH и температуры к блоку сбора данных и управления, как описано в шагах 2.2-2.3. Откалибруйте и обновите уравнение преобразования для канала pH , как описано в шагах 3.3 и 4. Igimg "src =" / files / ftp_upload / 55545 / 55545fig4.jpg "/> Рисунок 4: Схема подключения микшера. На этой диаграмме показано, как настроить микшерное устройство для PBR с помощью мини-редуктора, источника питания и трехмерной печати рабочего колеса и вала. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Настройте PBR внутри инкубатора с контролируемым температурой с принадлежностями и датчиками. Для визуализации см . Рисунок 4 . Настройте датчик освещенности внутри PBR, просунув провод датчика освещенности через порт крышки, а затем установите головку датчика на держатель удлинителя крышки с помощью прилагаемого винта. Используйте резиновую пробку или прокладку, чтобы поддерживать этот порт в атмосфере. Прикрепите и закрепите рабочее колесо смесителя на крышке PBR, установив вал рабочего колеса на двигатель мини-редуктора постоянного токаВал внутри крышки PBR; Закрепите вал с помощью установочного винта и шестигранного ключа. Добавьте среду для роста водорослей, поместите крышку и закрепите крышку винтами. Поместите PBR внутри инкубатора (установите на 25 ° C или желаемую температуру). Вставьте датчик температуры в указанный порт и закрепите его в порту с помощью резиновой пробки. Закрепите pH-зонд в порту крышки реактора с помощью резьбового крепления PG-13.5. Подключите провода светочувствительного датчика к блоку сбора данных, как описано в шаге 2.1. Установите рабочее колесо смесителя на желаемую скорость. Настройте переменный источник питания постоянного тока рядом с настройкой. Включите питание и отрегулируйте регулятор напряжения до тех пор, пока значение напряжения не станет 0 вольт. Выключите питание. Подключите линии питания двигателя крыльчатки к положительным и отрицательным выходным клеммам переменного источника питания ( рис. 5 </stroнг>). ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ. Никогда не подключайте и не прикасайтесь к живым проводам или цепям. Перед подключением всех проводов убедитесь, что все источники питания отключены. Всегда следите за инструкциями производителя / спецификациями, чтобы обеспечить совместимость между двигателем, источником питания и проводами. Включите питание и медленно увеличивайте напряжение, повернув ручку напряжения до тех пор, пока не будет достигнута желаемая скорость смешивания; Рассчитать скорость перемешивания путем измерения оборотов в минуту. Рисунок 5: Схема экспериментальной установки реактора. Визуализация экспериментальной установки PBR в термоуправляемом инкубаторе. Эта настройка включает в себя лампу роста и PBR, с датчиками и смесителем, закрепленными внутри крышки PBR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобыПросмотрите большую версию этого рисунка. Установите лампу роста, чтобы осветить PBR. ПРИМЕЧАНИЕ. Для достижения уровней интенсивности фотосинтетического света, необходимых для этого исследования Dunaliella, была выбрана мощная светодиодная лампа, излучающая синий и красный спектр. Размер и форма светильника должны выбираться таким образом, чтобы свет равномерно освещал падающую поверхность PBR. Убедитесь, что инкубатор может работать с внутренним источником тепла. Это не может сократить срок службы инкубатора и / или может привести к повреждению или чрезмерному нагреву в инкубаторе. Центрируйте растущую лампу вдоль передней поверхности PBR. Убедитесь, что путь света направлен непосредственно на датчик освещенности, установленный на задней части реактора. Включите свет и отрегулируйте интенсивность света по мере необходимости, перемещая растущую лампу прямо в реактор или от него. Проверьте дисплей датчика на наличие светачтения. Контролируйте и регистрируйте данные датчика в течение 6-24 часов, чтобы гарантировать, что показания света, температуры и рН в пределах PBR являются стабильными и в пределах требуемого диапазона. При необходимости отрегулируйте. ПРИМЕЧАНИЕ. Электрические шумы часто наблюдаются с помощью отскоков, нестационарных показаний и / или резких сдвигов значений без явных изменений в среде PBR. Удалите резиновую пробку на порт для отбора проб, чтобы добавить инокулят водорослей через переносную пипетку. Удалите образцы и проверьте условия, чтобы они оставались в пределах диапазона, необходимого для эксперимента. Удалите культуры для анализа по мере необходимости из порта выборки с помощью пипетки. ПРИМЕЧАНИЕ. Объем образца, частота и продолжительность эксперимента будут зависеть от шага 1.1.2. Контролируйте температуру воды внутри PBR, проверив отображение данных в программном обеспечении и вручную настроив заданное значение температуры воздуха в инкубаторе, чтобы сохранить температуру водыПостоянная. ПРИМЕЧАНИЕ. Эта настройка будет зависеть от инструкций производителя инкубатора. Контролируйте и отрегулируйте pH в пределах PBR, если хотите, чтобы гарантировать, что pH остается в пределах ожидаемого диапазона для экспериментов. ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь рН контролировали 12-вольтовым электромагнитным клапаном (обычно закрытым) в соответствии со сжатым баллоном CO2 (99,99%). Клапан открывался по мере необходимости с использованием функций управления блоком сбора данных и управления и программного обеспечения. Эта настройка требовала дополнительной платы реле и модулей постоянного тока и была реализована с использованием пользовательского компьютерного программирования, адаптированного к конкретным целям исследований.

Representative Results

Данные из этой системы мониторинга в реальном времени показывают динамическую среду для выращивания водорослей в масштабе шкалы PBR и подчеркивают необходимость мониторинга и контроля системы. Зарегистрированные данные о температуре ( рис. 6 ) демонстрируют, как световая подсветка, температура воздуха в инкубаторе и диссипация энергии, связанные с ростом водорослей, могут изменять температуру внутри PBR и как данные в реальном времени могут использоваться для настройки контроля температуры инкубатора по мере необходимости. Измеренный свет в течение эксперимента дополнительно подчеркивает динамический характер этой растущей среды. Как видно на рисунке 7 , показание светового датчика, измеренное как плотность фотосинтетического фотонного потока (PPFD, μE-m -2 с -1 ), составляло ~ 100 PPFD до добавления водорослей и немедленно отбрасывалось до 85 PPFD afВ которой инокулируют реактор культурой водорослей. На 7-й день свет продолжал падать менее чем на 5 PPFD. Это уменьшение интенсивности света связано с увеличением количества биомассы и клеток и / или увеличением поглощения за счет увеличения содержания хлорофилла, что показывает, что водоросли активны через 7-й день, несмотря на низкую Уровень освещенности. Дополнительные биологические измерения необходимы для дальнейших выводов. Данные с непрерывным регистрированием рН показывают, что в целом в этом эксперименте рН был адекватно контролирован с помощью реализованного алгоритма регулирования рН ( рисунок 8 ). Эти данные, показывающие как поминутные показания, так и среднечасовые показатели, демонстрируют несколько ключевых моментов в отношении культивирования водорослей и мониторинга рН в реальном времени. Во-первых, рН повышался выше желаемого уставки 7,6 сразу после инокуляции PBR водорослями. Это изменение ожидалось, поскольку культурное семя, которое было добавлено к PBR, имело apH выше, чем заданное значение, поскольку колбу, используемую для выращивания посевного материала, не контролировалась pH. Во-вторых, эти данные в реальном времени показывают, насколько чувствительны электроды pH к внешним электрическим шумам. Эта чувствительность отмечена резким скачком значений электродов между днями 1 и 2 дня. Эти внезапные изменения значений рН, вероятно, создавались электрическими шумами соленоидного клапана из соседней экспериментальной установки. Это электрическое возмущение преждевременно инициировало алгоритм регулирования pH для введения CO 2 в PBR. Следовательно, рН опустился ниже желаемой уставки. Чувствительность рН-электродов может приводить к экстремальным выбросам и потенциально может нарушить работу систем управления. Рисунок 3: Графики зависимости рН и калибровки. ( A ) Пример графика ответа thE pH-датчик ( b ) Пример калибровочного графика датчика pH с использованием уравнения для преобразования. Регрессионный анализ показывает 95% доверительный интервал. Ошибки не отображаются (стандартная ошибка меньше 0,03%). Эти графики показывают, что датчики рН были подключены правильно и что его сигнал был очень устойчивым. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Измерения температуры внутри PBR Во время 7-дневного эксперимента. Темно-синие точки представляют собой средние значения данных датчика, составляющие 1 час, а светло-голубые – представляют собой показания датчиков, полученные за 1 мин (время обнаружения 1 с, средняя длина 60) и преобразуются в температуру с использованием коэффициентов преобразования, поставляемых изготовителем. Черные стрелы W, когда настройка температуры инкубатора была отрегулирована для поддержания температуры культивирования около 25 ° C (эта желаемая уставка обозначена красной пунктирной линией). Колебания температуры обусловлены ростом водорослей и изменением температуры инкубатора. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 7: Измерения света внутри PBR Во время 7-дневного эксперимента. Темно-синие точки представляют собой средние значения данных датчика, составляющие 1 час, а светло-голубые – представляют собой показания датчиков, полученные за 1 мин (время обнаружения 1 с, средняя длина 60), и преобразуются в ППФД, используя значения заводской калибровки по умолчанию для светового датчика."> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 8: Измерения рН внутри PBR во время 7-дневного эксперимента. Темно-синие точки представляют собой средние значения данных датчика в среднем в течение 1 часа, а светло-голубые точки представляют собой показания датчиков, регистрируемые каждые 1 мин (время сбора 0,1 с, средняя длина 600) и преобразуются в рН с использованием уравнения преобразования, установленного с помощью калибровки. РН поддерживали между 7,6 и 7,5 с использованием 99% -ной закачки CO 2 . Красные пунктирные линии указывают желаемый диапазон pH. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Эта система PBR предлагает возможность контролировать и контролировать экспериментальные эксперименты по кинетическому росту в масштабе всей скважины, позволяя получить более повторяемые результаты экспериментальных анализов, используемых для количественного определения роста. Однако понимание ограничений и неопределенностей измерений датчиков имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы показания датчика точно отражали условия реактора. Это понимание включает базовые знания принципов измерения, связанных с датчиками, процесса и частоты калибровки, неопределенности измерения и того, что датчик может и не может измерить. Например, электрический отклик для описанного здесь светочувствительного датчика неравномерно распределен по видимому диапазону спектра, и на выход датчика могут потребоваться некоторые поправочные коэффициенты, в зависимости от того, как будут анализироваться данные этого датчика.

Температурные уровни и вариации также чрезвычайно важны, так как изменения температуры могут резкоФлюидизацию отклика датчика. Важное значение имеет также понимание потенциальных помех, которые могут повлиять на показания датчиков. Эта помеха может представлять собой окружающий электрический шум из здания или может быть обусловлена измерительной средой ( например, ионы натрия могут резко влиять на показания рН при значениях рН более 10) ¹² . Более того, погружение нескольких зондов в раствор, особенно высокоионный и проводящий раствор соли, также является потенциальным источником помех. Электроды, которые измеряют рН (или ионную силу, растворенный кислород, растворенный СО ₂ и т . Д.), Особенно чувствительны к окружающим электрическим шумам и могут быть легко возмущены. Сигнальное кондиционирование, используемое для защиты электродного сигнала, не может гарантировать, что другие факторы не будут мешать показаниям зонда. В рамках контроля качества для проверки t следует использовать другое лабораторное оборудование, такое как ручной pH-зонд, ручной спектрометр и термометр.Показания датчика и убедиться, что система настроена и работает правильно.

Другим ограничением, которое необходимо решить, является возможное воздействие водорослей и / или среды культивирования на датчики. Например, если мусор или пузырьки водорослей покрывают фотодиодный рецептор светочувствительного датчика, это повлияет на показания. Точно так же pH-электроды чрезвычайно чувствительны и требуют особой осторожности для обеспечения точных показаний. Эти электроды работают путем измерения разности напряжений во внутреннем соединении из-за накопления ионов H ⁺ ; Для поддержания точных измерений требуется гидратированный буферный слой внутри зонда ¹² . В зависимости от условий в реакторе этот слой будет изнашиваться, и отклик датчика может измениться в течение эксперимента, когда зонд погружен в воду. В предварительных испытаниях выходное напряжение рН не дрейфовало более чем на 0,2 единицы рН в течение 20-дневного эксперимента, Но необходимо провести дальнейшие оценки, чтобы охарактеризовать это изменение чувствительности сенсора и установить максимальное время экспериментального эксперимента, особенно если требуются мелкие корректировки / количественные значения рН.

Многие современные настольные системы PBR, созданные для анализа роста водорослей, не контролируют и не контролируют внутреннюю культуральную среду настолько жестко, насколько это необходимо, чтобы понять, как разные факторы влияют на рост водорослей, поскольку создание таких систем может быть сложной задачей. Этот протокол может помочь облегчить более контролируемые эксперименты, предоставив пошаговые инструкции для построения PBR с мониторингом в реальном времени. Более того, эти данные в реальном времени могут использоваться не только для лучшего контроля экспериментальных условий, но и могут быть использованы для оценки кинетики роста ( например, показания оптической плотности в качестве эталона для общих темпов роста).

Контролируемые экспериментальные системы могут помочь сделать исследования водорослей более воспроизводимыми. Сканирующая шкала PBR sEtrops, которые контролируются и контролируются, могут повысить эффективность эксперимента, минимизируя непреднамеренные артефакты в экспериментальном дизайне и могут помочь в продвижении усилий по превращению водорослевого биотоплива в устойчивый альтернативный источник топлива.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признают Национальный научный фонд «Новые рубежи в исследованиях и инновациях» (Премия № 1332341) за финансирование этого исследования. Авторы также хотели бы поблагодарить д-ра Эндрю Гришофа, а также сообщества поддержки LabJack и DAQFactory за их помощь и помощь, предлагаемые на протяжении всего этого процесса.

Materials

Cast acrylic sheets	McMaster Carr	8560K244	7/8'' thick, 12×36'', optically-clear, the size of sheets purchased will depend on reactor dimensions.
Acrylic cement	McMaster Carr	7517A4	Scigrip plastic pipe cement, #4SC nonwhitening for acrylic. Not needed if gaskets and screws are used for PBR assembly.
Acrylic cement applicator needle	McMaster Carr	75165A136	Acrylic cement applicator needle, 25 Gauge, 1", Stainless steel, PTFE lined.
Plastic dispensing bottle for acrylic cement	McMaster Carr	7544A67	Plastic dispensing bottle, 2-oz size, packs of 5.
Viscous acrylic cement	McMaster Carr	7515A11	Scigrip plastic pipe cement. Medium-bodied acrylic cement to seal in any gaps within PBR body.
PG-13.5 thread tap	McMaster Carr	2485A14	Can be used to help secure pH electrode to lid (if applicable).
PBR and lid	NCSU Precision Machine Shop	Karam Algae 3.2L Reactor Revision E	This machine shop is open to public for business. Contact shop manager.
pH sensor	Hamilton	238643	EasyFerm Plus 120, autoclavable, millivolt output.
Light sensor	Apogee Instruments	SQ-225	Amplified 0-5 volt electric calibration quantum sensor, water-proof.
Temperature sensor	LabJack	EI1034	Stainless steel, water-proof temperature sensor.
pH transmitter wire with BNC end	Sigma-Aldrich	HAM355173-1EA	This wire will vary with type of pH probe. Make sure wire is compatible with pH probe and has BNC connector end.
Unity gain pre-amplifier	Omega Engineering	PHTX-21	Signal processing amplifier for pH electrode needed for high-impedance pH readings.
Coaxial adapter, BNC female-to-binding post	Amazon	SMAKN B00NGD5K80	For connecting pH signal from pre-amplifier to microcontroller.
Capacitor (1000 uF)	Amazon	Nichicon BCBI4950	For low-pass filter.
Resistor (1000 ohm)	Radio Shack	2711321	For low-pass filter.
Hookup wire	RadioShack	2781222	For making low-pass filters, connecting sensors to microcontroller, and wiring motor.
Heat shrink tubing	RadioShack	2781611	For low-pass filter assembly.
Data acquisition and control unit	LabJack	LabJack U6	To process electrical signal from sensors and communicate with data acquisition and control software.
DAQFactory data acquisition software	DAQFactory	DAQFactory Express Release 5.87c Build: 2050	Free to download, for up to 10 channels.
Mini DC-gearmotor	McMaster Carr	6331K31	Motor for mixer impeller.
Impeller and shaft	N/A	N/A	Email authors for 3D files.
Variable DC power supply	Amazon	Tekpower HY1803D	Variable DC power supply, 0-18V @ 0-3A.
Grow Lamp	HydroGrow	SOL-1	This exact model is no longer available.
Incubator	Thermo Scientific	Precision Model 818	This particular incubator can withstand an internal heat source since this unit's cooling compressors run non-stop regardless of temperature setting.

References

Liu, X., Clarens, A. F., Colosi, L. M. Algae biodiesel has potential despite inconclusive results to date. Bioresour. Technol. 104, 803-806 (2012).
Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25 (3), 294-306 (2007).
Lardon, L., Hélias, A., Sialve, B., Steyer, J. -. P., Bernard, O. Life-cycle assessment of biodiesel production from microalgae. Environ. Sci. Technol. 43 (17), 6475-6481 (2009).
Henry, W. Experiments on the Quantity of Gases Absorbed by Water, at Different Temperatures, and under Different Pressures. Philos. Trans. R. Soc. London. 93 (1803), 29 (1803).
Wang, X., Hao, C., Zhang, F., Feng, C., Yang, Y. Inhibition of the growth of two blue-green algae species (Microsystis aruginosa and Anabaena spiroides) by acidification treatments using carbon dioxide. Bioresour. Technol. 102 (10), 5742-5748 (2011).
Juneja, A., Ceballos, R. M., Murthy, G. S. Effects of Environmental Factors and Nutrient Availability on the Biochemical Composition of Algae for Biofuels Production: A Review. Energies. 6 (9), 4607-4638 (2013).
Bernard, O. Hurdles and challenges for modelling and control of microalgae for CO 2 mitigation and biofuel production. J. Process Control. 21 (10), 1378-1389 (2011).
Guest, J. S., van Loosdrecht, M. C. M., Skerlos, S. J., Love, N. G. Lumped Pathway Metabolic Model of Organic Carbon Accumulation and Mobilization by the Alga Chlamydomonas reinhardtii. Environ. Sci. Technol. 47 (7), 3258-3267 (2013).
Packer, A., Li, Y., Andersen, T., Hu, Q., Kuang, Y., Sommerfeld, M. Growth and neutral lipid synthesis in green microalgae: A mathematical model. Bioresour. Technol. 102 (1), 111-117 (2011).
Oren, A. A hundred years of Dunaliella research: 1905-2005. Saline Systems. 1, 2 (2005).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Karam, A. L., McMillan, C. C., Lai, Y., de los Reyes III, F. L., Sederoff, H. W., Grunden, A. M., Ranjithan, R. S., Levis, J. W., Ducoste, J. J. Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests. J. Vis. Exp. (124), e55545, doi:10.3791/55545 (2017).

Automatically Generated