動力学的成長試験のための温度、光およびpHモニタリングを有するベンチスケール藻類光合成バイオリアクターの構築およびセットアップ

1.ベンチスケールのPBRボディとリッドを構築する注：説明の目的で、 Dunaliella sp。 、細胞壁を欠く約10μmの耐熱性微小藻類を、このPBRの構築のためのモデル生物として使用した。 研究ニーズに必要なPBR量を決定する。 このPBRの実験目的を決定する。 アッセイに必要な量を含む、藻類測定アッセイ（ M ）が藻類種の成長を特徴付けるのに必要であるかどうかを決定する;技術的複製の数n ;サンプリング周波数f ;実験の継続時間、 t 。 注：プロジェクト特有の研究課題、藻類種、利用可能な機器は、測定された藻類の特性、これらの測定に使用された方法、およびこれらの測定がどれくらい頻繁に行われるかを決定する。バイオマス;細胞数;合計葉緑素色素、タンパク質、脂質、炭水化物、および外部硝酸塩濃度測定は、成長を評価する一般的な方法であり、5〜14日間の毎日のサンプリングは、増殖試験9,10についての一般的なアプローチである。 式6を用いて、1回の実験を通してサンプリングに必要な総培養体積V sを計算する 。 式（7）を用いて、ステップ1.1.3からのV sと最大体積除去率Fを用いて、目標PBR体積V pを推定する。 注記：PBR内の条件（混合パワー、光分布など ）を確実にするためには、全培養量（ 例えば 20％以下）培養容積が除去されるにつれて、実験の過程にわたって変化する。 バイオマスが10日間の実験であると仮定すると、細胞数;タンパク質、脂質、炭水化物、および硝酸塩の総濃度を毎日3回測定し、合計サンプリング容量約600mLを使用する。全培養容積の18.75％以下を除去することを目的とする場合は、少なくとも3.2Lの全作業槽容積を使用する。 PBR実験用のセンサーとアクセサリーを選択してください。 連続モニタリングに使用するpHプローブ、ライトプローブ、および温度プローブを選択します。 注：センサーはデータ取得ユニットと互換性があり、内部の培養条件（pH範囲、光、熱、藻類の破片、塩など ）に耐えなければなりません。ここでは、 Dunaliella sp。海洋微小藻類である。 exを満たすインペラーの設計とモーターを選択する周囲の混合要件。 注：例えば、低せん断の軸方向羽根車は、細胞壁がなく容易に剪断することができるため、 Dunaliella藻類にとっては良い選択です。これらの藻類は鞭毛の移動を有し、強い混合を必要としない11 。低い混合速度は、12 Vのミニギアモータを使用して達成することができます。インペラとシャフトは3D印刷できます（3D印刷情報は材料リストにあります）。 PBR本体とふたを組み立てます。 ステップ1.1の体積計算に基づいて、実験目的および潜在的な制約（ 例えば、空間）を念頭に置いて、反応炉の寸法を決定する。 注：この形状はPBR全体の光減衰を最小限に抑え、実験を通してより一貫した光分布を提供するので、より低い表面対体積比を有するPBR設計が好ましい。 光学的に透明なキャストの5つの部分をカットステップ1.3.1で確立されたPBR設計およびサイズに従って、テーブルソーを用いてアクリルシート（厚さ約0.25〜0.5インチ）を形成する。 200~400グリットのサンドペーパーを使用して、ジョイントの端が滑らかにされているが、丸められていないことを確認します。 テープやクランプと一緒にアクリル部分の端を固定します。 注：アクリルセメントは接着剤ではありません。アクリル結合面が粗い場合、またはアクリル片が均一に整列しない場合、この結合セメントは有効ではない。 換気の良い場所で、針ディスペンサーを使用して関節に沿ってアクリルセメントを塗布する。プラスチックの表面はすぐに一緒に付着します。ピースを24時間放置する。 警告：アクリルセメントを使用するときは、マスクや手袋を着用して、吸入や皮膚に触れないようにしてください。 PBRが水密であることを確認するために、粘性アクリルセメントをジョイントに塗布します。セメントの指示に従ってセメントを24〜48時間乾燥させておいてください。乾燥時間は変化し得る。 記入してください目に見える漏れを確認するために水を入れてください。漏れがない場合は、リアクタをペーパータオルに置き、24-36時間後に漏れの兆候がないか再確認してください。 注：〜2 Lを超えるPBRを組み立てるには、厚さ0.5インチ以上のアクリルシートを使用する必要があります。薄いシートは水圧下で撓んでリークを起こすことがあります。ガスケットおよび再強化ネジは、アクリルセメントのより堅牢な代替物として使用できます（ 図1 ）。このタイプの組み立てには精密機械が必要であり、アクリルは容易に割れるので、非常に慎重に行う必要があります。 PBRリッドの設計には機械工場を使用し、センサやその他のPBRアクセサリやニーズ（インペラ、ガスライン、サンプリングポートなど ）を収容するポートを備えています。内部コンポーネントが相互に干渉しないようにしてください。 注記：PBRおよびPBRリッドの構成/設計は、リアクターの付属品および実験の目的に依存します。 図1を参照PBRリアクタとリッドの設計例（詳細は材料のセクションを参照してください）。このPBR設計は、プロトコルの残りの部分について参照されます。 図1：センサとミキサを備えたカスタマイズされたベンチスケールのPBRセットアップのイメージこの設定では、ミキサー、蓋のねじ穴を通して蓋に固定された電極、特別に設計された蓋に取り付けられた光センサーが示されています。この蓋のデザインには、12 V DCミニギアモーターの取り付けも含まれています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 2.データ集録/制御ユニットによるセンサーのセットアップと構成注：センサは、物理的な世界を測定可能なアナログ信号、しばしば電圧に変換します。データ収集ユニットは、デジタル世界と物理世界との間のインターフェイスとして機能し、これらのアナログ信号を読み取り、それらをコンピュータによって指示された離散値に変換するために使用することができる。ここで説明するデータ取得ユニットは、16ビットのアナログ入力分解能を持ち、最大14のアナログ信号（±10V）を読み取ることができ、一部のセンサー（最大5V）に必要な電力を供給することができます。これらの手順では、アナログ信号をPBR内の光、pH、および温度のより意味のある値に変換するために、このデータ集録/制御ユニットを設定する方法の概要を示します。これらの指示には、これらの測定値を完全に解釈し、不確かさを定量化するために必要な重要な概念（ すなわち 、量子化、精度、応答時間など ）は詳しく述べられていません。 <br/> 図2：センサ – データ収集/制御ユニット接続図この図は、pH、光、および温度センサーをこのプロトコルに使用されるデータ収集および制御ユニットに設定する方法を示しています。 pHおよび光センサーの信号処理コンポーネントが示されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 ローパスフィルタを使用してデータ取得/制御ユニットで光センサをセットアップして設定します。 注記：一般的な参考図については、 図2を参照してください。メーカーのセンサ仕様は、信号線、電源線、およびアース線の色による違いを示します。ローパスフィルタは、電気信号から不要なノイズを除去するために抵抗とコンデンサを使用する単純な回路です。このタイプのフィルタは、より高い周波数の電気信号を減衰させますnは抵抗と容量によって決まるカットオフ周波数です。このフィルタは、センサ信号から電気ノイズを除去または平滑化するのに役立ちます。 ワイヤーストリッパーを使用して、〜2インチの緑のコネクターワイヤーを切断します。片方の端部を絶縁して0.25インチ、他方の端部から約0.5インチを取り除く。 光センサーのアナログ信号出力線を識別します。少なくとも0.25~0.50インチの金属線が電線の絶縁部を越えて露出していることを確認してください。 1000Ω抵抗の片方の脚部をコネクタワイヤの約0.5インチの剥いた端に注意して包んでください。光センサーのアナログ信号線の露出部分の周りに抵抗のもう一方の脚を包みます。 抵抗器の脚をワイヤにはんだ付けするには、はんだ付け用の鉛フリーはんだを使用してください。はんだを2〜5分間冷却させます。 警告：はんだとはんだごては非常に高温になり、ユーザーが適切な訓練を受けていないと非常に危険です。教育ビデオはオンラインで見つけることができます。安全眼鏡などの予防措置は非常に重要です。このプロセス中に電線を電源装置または他の装置に接続しないでください。 コネクタワイヤの一方の端に約1.5インチの熱収縮チューブを差し込み、はんだ付けされたワイヤと抵抗を覆うまでピースをスライドさせます。すべての金属部分が完全に覆われていることを確認してください。 ヒートガンを使用して熱収縮させる。チューブが抵抗とワイヤの周りをしっかりと包み込むようにしてください。露出した裸線はない。 ドライバーを使用して、光センサーのアース線をデータ集録/制御ユニットのグラウンド（GND）端子に接続します。 ドライバーを使用して、シグナルコネクタワイヤの自由端をフリーアナログ入力（AIN）端子に固定します。 ステップ2.1.8と同じAIN端子と負のリード（ つまり短い方のレッグ）に、ステップ2.1.7と同じGND端子に1,000μFコンデンサの正のリード線（ つまり長い方のレッグ）を固定します。コンデンサの脚と電線の両方が端子にしっかりと接続されていることを確認してください。 光センサーの電源入力線を特定し、この電線をデータ集録/制御ユニットの電圧源（VS）端子に固定します。 ユニティゲインアンプとローパスフィルタを使用してデータ収集ユニットでpH電極を設定して設定します。 注：pH測定の性質（ すなわち 、高インピーダンスおよび低電圧）のために、pHプローブとデータ収集装置との間に単一利得増幅バッファがしばしば必要とされる。ローパスフィルタは周囲の電気ノイズから信号を保護するためにpHを測定するのにも有益です。 トランスミッタワイヤを使用してユニティゲインアンプをpHプローブに接続します。 正と負のポート端子を持つ同軸アダプタをユニティゲインアンプの他端に接続します。 緑色の6インチのピースを2枚とピペットを1枚カットしますワイヤーストリッパーを使用して黒色コネクターワイヤーを切断します。黒いコネクターワイヤーの両端から約0.25インチの絶縁材を剥がします。 ワイヤーストリッパーを使用して、緑色のコネクターワイヤーの端部から約0.25インチおよび約0.5インチの絶縁材を剥がします。 1つの緑色のコネクタワイヤの約0.5インチの剥がれた部分の周りに、1000Ω抵抗の1脚を慎重に包んでください。もう一方の緑色のコネクタワイヤの約0.5インチの剥ぎ取られた部分の周りに、他の抵抗器の脚部を包みます。 抵抗器の脚をワイヤにはんだ付けするには、はんだ付け用の鉛フリーはんだを使用してください。はんだを2〜5分間冷却させます。 コネクタワイヤの一方の端に約1.5インチの熱収縮チューブを差し込み、はんだ付けされたワイヤと抵抗を覆うまでピースをスライドさせます。すべての金属部分が完全に覆われていることを確認してください。 ヒートガンを使用して熱収縮させる。プラスチックが抵抗とワイヤの周りをしっかりと包み込むようにしてください。露出した裸線はない。 黒いcの一端を固定する（黒）の端子ポストに接続します。このワイヤのもう一方の端をデータ集録/制御ユニットのGND端子に差し込み、ドライバを使用して固定します。 緑色のコネクタワイヤの一端（抵抗器を直列に接続）を同軸アダプタの正の（赤色の）端子ポストに固定します。このコネクタワイヤのもう一方の端を、データ集録/制御ユニットの空いているAIN端子に挿入します。 1000μFコンデンサの正のリード線（ つまり長い方の端子）を識別し、このリードをステップ2.2.9と同じAIN端子に固定します。コンデンサの脚と信号線の両方が端子に確実に接続されていることを確認してください。 ステップ2.2.8と同じGND端子に、1,000μFコンデンサの負のリード（短い方のレッグ）を固定します。 信号、グランド、および電源を接続して、温度センサーをデータ集録および制御ユニットに接続します。AIN、GND、およびVS端子を解放するためにプローブの両端に接続します。 3.ライブデータの取得と実験ファイルの設定注記：ここで説明するデータ収集および制御ソフトウェアは、データ取得および制御ユニットと通信して、ユーザ指定の時間間隔でセンサデータをモニタおよびロギングします。以下の手順では、このソフトウェアでpH、温度、および光を監視および記録するための制御ファイルを設定する方法について説明します。これらの手順は、資料セクションに記載されているソフトウェアとデータ集録および制御装置に固有のものです。詳しい説明は、製品のユーザーマニュアルに記載されています。 USBケーブルを使用して実験装置の近くのコンピュータにデータ集録/制御装置を接続し、必要なすべてのドライバをダウンロードします。 データ集録および制御ソフトウェアをダウンロードして開きます。 ソフトウェアの各センサーに「コンバージョン」を設定します。 注：物理的なボルトを変換するには年齢信号を意味のある値に変換するには、較正によって確立された変換係数を適用する必要があります。多くのセンサーには、製品固有の仕様書に記載されている工場較正ファクターが付属しています。変換式は、セットアップとセンサーに固有のものです。多くの変換式パラメータ、特に電極用のパラメータは、較正によって定期的に更新する必要があります。センサの寿命と校正頻度は、製品固有の仕様と作業環境に依存します。 注記：ユーザーはこれらの仕様を完全に読んで理解する必要があります。 表1は、材料リストにあるセンサの変換を示しています。温度プローブの変換例を以下に示します。 メインのホームページの右側にあるソフトウェアワークスペースの「コンバージョン」に移動します。 「volts_to_celsius」などのコンバージョン名を追加し、変換式を入力します（55.56 x 値）+ 255.37-273.15。 チャネル名 コンバージョン名 式 ノート 温度 volts_to_celsius （55.56×値）+ 255.37-273.15 ボルトを摂氏に変換するメーカー変換式。 光 volts_to_PPFD 値x 500 電圧を光合成光子束密度（μmolm -2 s -1 ）に変換するメーカーの変換係数、メーカーのLED補正は適用されません。 pH volts_to_pH （-17.05×値）+ 6.93 pH電極の電圧値をpH値に変換するための校正依存変換式（図4b）。 pHチャネルにのみ変換を適用する較正を行う。 表1：データ取得ファイルのチャネル変換テーブルセンサーのチャネル情報と変換情報をデータ収集ソフトウェアに入力する方法の例。 センサーデータを取得するには、ソフトウェア内の各センサーに適切なチャネルを設定します。 注記：各センサーには、ソフトウェア内の独自のアナログ – デジタルチャネルと、データ集録/制御ユニット内の指定アナログ入力端子が必要です。 ソフトウェア内の「チャンネル」ページに移動します。 センサーチャネル名を追加します。スペース文字は使用できません。 適切なデバイスを選択して、対応するチャネルのデータを収集します。このデバイスはデータ取得デバイスに対応します。 データ取得・制御ユニット等を参照するための機器番号を入力してくださいデータ取得装置。 1つのユニットしか使用されていない場合、デフォルトの数はゼロであることが多い。 入出力タイプ（「I / Oタイプ」）のアナログ – デジタル「A〜D」を選択し、データ取得制御ユニットのAIN端子番号に対応するチャネル番号を入力します希望のサンプリング「タイミング」を入力します。この値は、センサー信号が読み取られる頻度を示します。 1.0を入力して、1秒ごとに読み取り値を取得します。ロギングの前に1分間隔でデータを平均化するには、「平均」ボックスをチェックし、平均化の長さを60と指定します。 該当する場合は、ドロップダウンメニューから適切なコンバージョンを選択します（コンバージョンを生成するには、ステップ3.3を参照）。そうしないと、すべてのチャンネルデータが電圧として表示/記録されます。 実験データを記録するために "Logging Set"を設定してください。 ソフトウェアワークスペース内の「Logging Panel」に移動し、ew logging setを実行し、それに応じて名前を付けます。出力ファイルの種類と場所を選択します。拡張子 '.csv'が出力ファイル名で指定されている場合、ASCIIファイルタイプはコンマ区切りの値ファイルを提供します。 このセットにログするために必要なすべてのチャネルを追加してください。 ワークスペースのロギング・シーケンスを右クリックし、適切なオプションを選択して、必要に応じてロギングを開始および停止します。 注記：データを積極的に記録するときは、ファイルにアクセスしないでください。この操作により、ロギングプロセスが中断される可能性があります。継続的に記録されたファイルのファイルの場所は、クラウドディレクトリに保存または書き込まないでください。 「ページ」を設定して、データとグラフを表示します。 ソフトウェアワークスペース内の「ページ」ディスプレイに移動します。デフォルトの空白ページのいずれかをクリックします。 ページ上に数値的に読み取ったセンサー出力を表示するには、ページに「変数値」表示を追加します。 リグ空白ページ内の任意の場所をクリックし、[表示]を選択し、[変数値]オプションをクリックします。小さなボックスが画面に表示されます。 この新しく作成されたボックスを右クリックし、[プロパティ]を選択します。ディスプレイのキャプション（例えば、「Temperature in Reactor」）、チャネル参照（「Temperature [0]」など）、および関連する単位（「摂氏」など）を入力します。 「OK」をクリックし、表示ページに戻ります。 センサデータをグラフィカルにリアルタイムで表示するには、2Dグラフを表示ページに追加します。 空白ページ内の任意の場所を右クリックし、[グラフ]を選択してから[2次元グラフ]を選択します。小さなプロットが画面に表示されます。 新しく作成したグラフを右クリックし、[プロパティ]を選択します。 "Traces"タブ内で、 "Y Expression："のボックスに希望のセンサーチャンネル名（たとえば "Temperature"）を入力し、 "Time"がwritteであることを確認します"X Expression："のボックスにnを入力します。 「OK」をクリックし、表示ページに戻ります。 4. pHプローブの校正注：pHキャリブレーションは、実験の前に実験の目的の温度で行う必要があり、それに応じてpHチャネル変換を更新する必要があります。 pH電極の測定値は実験中に変動することがあります。このドリフトの程度を判定するために、実験セットアップを実行した後に較正プロセスを繰り返し、測定値を比較する。 pH電極は、製造者の指示に従って、実験の前後に適切な保存溶液に適切に保存しなければならない。 ステップ2の説明に従って、pHセンサーと温度センサーを接続します。 pH電極と温度プローブの両方をpH校正バッファー7に挿入します。 プローブの温度が所望の温度になっていることを確認するために、グラフィックディスプレイを確認してください実験を実行する（ステップ3.6.2.2）。 pH電極の電圧出力が安定するようにします（ つまり、電圧の読み値はもう一方向に変化しません）。安定化を確認するには、グラフィック表示を使用してください。 温度とpHの電気的データを30秒〜60秒間ファイルに記録する（ステップ3.5）。このプロセス中、pHチャネルにはいかなる変換も適用してはいけません。 注：pH電極は電気的ノイズに敏感であるため、pHチャネルのサンプリングタイミングが遅い方が望ましい場合があります（ たとえば、 「タイミング」= 0.1秒）。タイミングが遅くなると、より多くの計算リソースが必要になることに注意してください。 バッファー4と10について較正を繰り返します。センサーの応答が-57〜-59 mV / pHの間であることを確認します（ 図3a ）。 pHバッファー値と電圧をプロットし、ラインをフィッティングすることにより変換式を生成する（ 図3b </strong >）。手順3.3で説明した変換式を更新します。 この変換をpHチャネルに適用し、チャネル設定を更新して、ロギングに必要な平均化を含めます。 5.藻類実験のためのPBRを設定する注：以下の手順は、 図1に示すDunaliellaとカスタムメイドのPBRに固有です。さらに、このシステムはこのように設計されていないので、これらの設定指示は無菌プロトコルには従わない。 実験および実験目的に必要に応じて、藻類接種物および増殖培地を調製する。 ステップ2.2-2.3で説明したように、pHおよび温度ワイヤをデータ収集および制御ユニットに接続します。 手順3.3および4で説明したように、 pHチャネルの変換式を較正し、更新します。 igimg "src =" / files / ftp_upload / 55545 / 55545fig4.jpg "/> 図4：ミキサーの配線図この図は、ミニギアモーター、電源、3Dプリントされたインペラーとシャフトを使用してPBRのミキシングデバイスを設定する方法を示しています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 付属品とセンサーを備えた温度制御インキュベーター内にPBRを設置します。視覚化については、 図4を参照してください。 リッドポートに光センサーワイヤーを通し、付属のネジを使用してセンサーヘッドをリッド延長マウントに取り付けて、光センサーをPBR内に設置します。このポートを大気に近づけないように、ラバーストッパーまたはグロメットを使用してください。 インペラーシャフトをDCミニギアモーターの上に置き、ミキサーインペラーをPBR蓋に取り付けて固定しますPBR蓋の内側のシャフト。シャフトを止めねじと六角レンチで固定します。 藻類特異的増殖培地を添加し、蓋をし、蓋をねじで固定する。インキュベーター内にPBRを置きます（25℃または希望の温度に設定）。 温度プローブを指定のポートに挿入し、ラバーストッパーを使用してポートに固定します。 pHプローブをPG-13.5ネジ式マウントを使用してリアクターのリッドポートに固定します。 手順2.1で説明したように、光センサーワイヤーをデータ収集ユニットに接続します。 ミキサー羽根車に所望の速度で動力を供給します。 設定に隣接して可変直流電源を設定します。電源装置の電源を入れ、電圧値が0ボルトになるまで電圧ノブを調整します。電源を切ります。 インペラモーターの電源ラインを可変電源の正および負の出力端子に接続します（ 図5 </strong>）。 警告：活線または回路を接続または触れないでください。ワイヤを接続する前に、すべての電源がオフになっていることを確認してください。モータ、電源、ワイヤ間の互換性を保証するため、製造元の指示書/仕様書を必ずお読みください。 電源を入れ、電圧ノブを回して所望の混合速度に達するまでゆっくりと電圧を上げます。 1分間当たりの回転数を測定することによって混合速度を計算する。 図5：リアクタ実験設定図温度制御インキュベーター内のPBR実験装置の可視化。この設定には、成長ランプとPBRが含まれ、センサーとPBRのふたの中に固定されたミキサーがあります。 ここをクリックしてくださいこの図のより大きなバージョンを見る。 成長ランプを設定してPBRを照らします。 注：このDunaliella特定の研究に必要な光合成光強度レベルを達成するために、青色および赤色スペクトルで発光する高出力LED成長ランプを選択した。照明器具のサイズと形状は、光がPBRの入射面を均一に照らすように選択する必要があります。保育器が内部の熱源を処理できることを確認します。そうしないと、インキュベーターの寿命を短くしたり、インキュベーター内の損傷や過度の加熱を引き起こす可能性があります。 PBRの前面に沿ってランプの中心を合わせます。光路がリアクタの背面に取り付けられた光センサに向いていることを確認してください。 光をオンにし、必要に応じて成長ランプを反応炉に向けてまたは反応炉から直接移動させることによって、光度を調節する。センサーの可変ディスプレイにライトが点灯していることを確認してください読書。 PBR内の光、温度、およびpHの測定値が安定しており、必要な範囲内にあることを確認するために、センサーデータを6〜24時間モニタリングして記録します。必要に応じて調整します。 注記：電気ノイズは、バウンス、不安定な読み取り、および/または突然の値の変化によって、PBR環境が明らかに変化することなく、しばしば観察されます。 サンプリングピペットのラバーストッパーを外し、藻類接種物を移送ピペットで加えます。 サンプルを取り出して、実験が望む範囲内に収まるように条件を監視する。 必要に応じて、ピペットを使用してサンプリングポートから分析のため培養物を除去する。 注：サンプル量、頻度および実験期間は、ステップ1.1.2に依存します。 ソフトウェアのデータ表示をチェックし、インキュベーターの空気温度を手動で調整して水の温度を維持することにより、PBR内の水温をモニターするR定数。 注：この調整はインキュベーターの製造元の指示に依存します。 必要に応じてPBR内のpHを監視して調整し、pHが実験の予想範囲内に収まるようにします。 注記：ここでは、pHは、圧縮されたCO 2タンク（99.99％）に合わせて12 Vソレノイドバルブ（通常閉）で制御されています。必要に応じて、データ取得および制御ユニットおよびソフトウェアの制御機能を使用してバルブを開けた。このセットアップではアクセサリリレーボードとDCモジュールが必要で、特定の研究目標に合わせたカスタムコンピュータプログラミングを使用して実装されました。