Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

Amanda L. Karam; Catherine C. McMillan; Yi-Chun Lai; Francis L. de los Reyes III; Heike W. Sederoff; Amy M. Grunden; Ranji S. Ranjithan; James W. Levis; Joel J. Ducoste

doi:10.3791/55545

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Bioengineering

Construcción y configuración de un biorreactor fotosintético de algas a escala de banco con control de temperatura, luz y pH para pruebas de crecimiento cinético

Published: June 14, 2017

doi:

10.3791/55545

Amanda L. Karam¹, Catherine C. McMillan¹, Yi-Chun Lai¹, Francis L. de los Reyes III¹, Heike W. Sederoff², Amy M. Grunden², Ranji S. Ranjithan¹, James W. Levis¹, Joel J. Ducoste¹

¹Department of Civil, Construction, and Environmental Engineering,North Carolina State University, ²Department of Plant and Microbial Biology,North Carolina State University

Summary

Este artículo describe el proceso de ensamblaje y operación de un biorreactor fotosintético a escala de laboratorio que puede usarse, junto con otros métodos, para estimar parámetros de crecimiento cinético pertinentes. Este sistema monitorea continuamente el pH, la luz y la temperatura usando sensores, una unidad de adquisición y control de datos y software de adquisición de datos de fuente abierta.

Abstract

El diseño y operación óptimos de los biorreactores fotosintéticos (PBRs) para el cultivo de microalgas es esencial para mejorar el desempeño ambiental y económico de la producción de biocombustibles basada en microalgas. Los modelos que estiman el crecimiento de microalgas en diferentes condiciones pueden ayudar a optimizar el diseño y la operación de PBR. Para ser eficaces, los parámetros de crecimiento utilizados en estos modelos deben ser determinados con precisión. Los experimentos de crecimiento de algas son a menudo limitados por la naturaleza dinámica del ambiente de cultivo, y los sistemas de control son necesarios para determinar con precisión los parámetros cinéticos. El primer paso para configurar un experimento controlado por lotes es la adquisición y supervisión de datos en directo. Este protocolo describe un proceso para el ensamblaje y operación de un biorreactor fotosintético a escala de laboratorio que puede usarse para llevar a cabo experimentos de crecimiento de microalgas. Este protocolo describe cómo dimensionar y ensamblar un PBR de placa plana, de escala de banco a partir de acrílico. También detalla cómo configurarUn PBR con monitorización continua de pH, luz y temperatura mediante una unidad de adquisición y control de datos, sensores analógicos y software de adquisición de datos de fuente abierta.

Introduction

Debido a las crecientes preocupaciones sobre el cambio climático global y los recursos finitos de combustibles fósiles, los gobiernos han estado desarrollando políticas para reducir el consumo de combustibles fósiles y alentar el desarrollo de nuevos combustibles de transporte sostenibles. La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos ha desarrollado el Estándar de Combustible Renovable (RFS), el cual requiere que 36 de los 140 billones de galones anuales de mezcla de combustible de transporte provengan de fuentes de combustible renovable para el 2022. Tecnologías innovadoras y transformacionales serán necesarias para cumplir estos y Normas futuras de energía renovable ¹ .

El uso de biocombustibles basados en microalgas tiene el potencial de ayudar a cumplir con la RFS nacional, al tiempo que reduce las emisiones de gases de efecto invernadero ² . Los biocombustibles basados en microalgas tienen varias ventajas en comparación con los biocombustibles de primera generación basados en cultivos terrestres, como el maíz y la soja. A diferencia de los biocombustibles de primera generación, las algas-bComo los biocombustibles consumen menos tierra, agua y recursos relacionados con los alimentos, ya que las algas pueden ser cultivadas durante todo el año y en tierras estériles usando agua salada o aguas residuales. Las microalgas tienen altas tasas de crecimiento en comparación con los cultivos terrestres y pueden acumular altos niveles de lípidos, que pueden convertirse fácilmente en biodiesel ³ . Actualmente, no existen plantas de algas a biocombustibles a escala industrial debido a los altos costos de los procesos de producción intensivos en energía, que consisten en cultivo de algas, separación de lípidos y refinación de lípidos en biodiesel. Se necesita más investigación para hacer estos procesos más eficientes y sostenibles.

PBRs, que son ópticamente claras, las instalaciones cerradas para la producción de microorganismos fototróficos en un entorno artificial, se consideran uno de los métodos de cultivo más prometedores ³ . Sin embargo, los diseños actuales todavía carecen de la productividad volumétrica necesaria para hacer el proceso de producción de algas a biocombustiblesMás eficiente y económicamente atractiva ⁴ . Poderosos modelos matemáticos que consideran la irradiancia y atenuación de la luz, el transporte de nutrientes y el CO ₂ , y el crecimiento de las microalgas pueden facilitar en gran medida la optimización del diseño y la operación del PBR. Se requieren experimentos de crecimiento a escala de banco para determinar los parámetros de crecimiento específicos de cada especie para estos modelos de optimización.

Las pruebas cinéticas requieren un cuidadoso monitoreo y control de las configuraciones experimentales para prevenir inhibidores no deseados del crecimiento. Dada la naturaleza fotosintética de las algas ( es decir, su consumo de CO ₂ y absorción de luz), el mantenimiento de condiciones controladas es especialmente difícil en los PBR de escala de banco. Como se representa en la Ecuación 1 , la cantidad de CO2 disuelto en el medio de crecimiento, comúnmente designado como ( Ecuación 2 ), será, como mínimo, unFunción de: 1) la presión parcial de CO ₂ y la constante de equilibrio de Henry, que dicta la cantidad de gas que se disolverá en solución ( Ecuación 3 ); 2) la composición química inicial del medio de crecimiento, que afecta la especiación y la actividad de los iones carbonato y el pH ( Ecuaciones 4 y 5 ); Y 3) la temperatura, que afecta a las ecuaciones 3-5 ⁵ .

Las diversas fases y la especiación química del carbono crean un reto para medir y mantener una concentración consistente de carbono disuelto dentro de un PBR queManteniendo otras condiciones constantes ( por ejemplo, el pH aumenta a medida que las algas consumen CO ₂ , y el aumento del sustrato de CO ₂ disuelto puede conducir a un ambiente ácido que inhibe el crecimiento) ⁶ .

Una capa adicional de complejidad para controlar las condiciones durante las pruebas cinéticas de las algas implica la intensidad de la luz dentro del PBR. La intensidad luminosa promedio dentro de un PBR es una función no sólo de la intensidad de la luz incidente, sino también del diseño ( por ejemplo, material, forma, profundidad y mezcla), la absorbancia de componentes de biomasa de algas (particularmente clorofila) Dispersión de las células de las algas. A medida que las algas crecen, la intensidad luminosa promedio disminuirá. Este cambio en la intensidad de la luz, ya sea causado por un aumento en las células totales y la biomasa, un aumento en el contenido de clorofila por célula, o ambos, puede eventualmente inducir una respuesta metabólica, como un aumento en la producción de clorofilaCción por célula o el uso de carbohidratos y productos de almacenamiento de lípidos para la energía ⁷ . El monitoreo continuo de la intensidad de la luz desde dentro del reactor proporciona información invaluable. Estos datos pueden ayudar a asegurar que las condiciones permanezcan dentro de un rango especificado y pueden usarse para ayudar a estimar los parámetros de crecimiento y absorbancia de algas si se combinan con otras mediciones ( es decir, biomasa, concentración de clorofila, profundidad del reactor, luz incidente, etc. ).

Entender cómo las algas crecen bajo un conjunto específico de condiciones requiere que el pH, el CO ₂ disuelto, la intensidad luminosa y la temperatura sean monitoreados en experimentos cinéticos a escala de laboratorio. Muchas configuraciones de crecimiento de algas no están equipadas para monitorear las condiciones en la medida requerida para calibrar modelos cinéticos, lo que hace que el proceso de modelado sea extremadamente desafiante ⁸ . Aunque muchas compañías ofrecen PBRs de escala de banco con automatización y control, estos bench-scalLas configuraciones de e pueden ser extremadamente caras (~ $ 20,000) y pueden no acomodar todas las consideraciones experimentales de una pregunta de investigación dada.

El primer paso para establecer un sistema de control-retroalimentación para un experimento por lotes es la adquisición de datos en directo. Este trabajo pretende demostrar cómo construir y montar un PBR de escala de banco equipado con monitoreo continuo de luz, pH y temperatura. Esta configuración de monitoreo en tiempo real puede ayudar a asegurar que las condiciones experimentales permanezcan dentro de los rangos deseados, a discreción del investigador. Aunque este protocolo no detalla mecanismos de control específicos, estas instrucciones paso a paso proporcionan una base básica para el marco de adquisición de datos requerido antes de que se puedan implementar retroalimentaciones de control más sofisticadas.

Protocol

1. Construya el cuerpo y la tapa de PBR de escala de banco NOTA: Para fines ilustrativos , Dunaliella sp. , Una microalga halotolerante de ~ 10 μm carente de una pared celular, se utilizó como organismo modelo para la construcción de este PBR. Determinar el volumen de PBR requerido para las necesidades de investigación. Determinar los objetivos experimentales para este PBR. Decidir qué ensayos de medición de algas, M , son necesarios para caracterizar el crecimiento de las especies de algas de interés, incluyendo el volumen requerido por ensayo, v ; El número de repeticiones técnicas, n ; La frecuencia de muestreo, f ; Y la duración de los experimentos, t . NOTA: Las preguntas de investigación específicas del proyecto, las especies de algas y el equipo disponible determinan las propiedades de las algas medidas, los métodos utilizados para estas mediciones y la frecuencia con que se toman estas medidas. Biomasa; Recuento de células; Y totalPigmentos de clorofila, proteínas, lípidos, carbohidratos y concentraciones externas de nitratos son formas comunes de evaluar el crecimiento, y el muestreo diario de 5 a 14 días es un enfoque común para las pruebas de crecimiento 9,10. Calcular el volumen total de cultivo, V _ { s } , requerido para el muestreo a lo largo de un experimento utilizando la Ecuación 6 . Utilice la Ecuación 7 para estimar un volumen de PBR objetivo, Vp , usando Vs de la etapa 1.1.3 y una fracción de eliminación de volumen máximo, F. NOTA: Eliminar menos de una fracción preespecificada del volumen total del cultivo ( por ejemplo, ~ 20%) puede ayudar a asegurar que las condiciones dentro del PBR , es decir, (potencia de mezcla, distribución de la luz, etc. ) no sean drásticasVarían a lo largo del experimento a medida que se elimina el volumen del cultivo. Suponiendo un experimento de 10 días donde la biomasa; Recuento de células; Y las concentraciones totales de clorofila, proteína, lípidos, carbohidratos y nitrato se miden diariamente por triplicado, usar un volumen de muestreo total de ~ 600 mL. Si se pretende retirar no más del 18,75% del volumen total de cultivo, usar un volumen de reactor de trabajo total de al menos 3,2 L. Seleccione sensores y accesorios para los experimentos de PBR. Seleccione las sondas de pH, luz y temperatura que se utilizarán para la monitorización continua. NOTA: Los sensores deben ser compatibles con la unidad de adquisición de datos y deben soportar condiciones de cultivo internas ( es decir, rango de pH, luz, calor, residuos de algas, sal, etc. ). Las sondas de acero inoxidable y tolerantes a la sal se seleccionaron aquí desde Dunaliella sp. Son microalgas marinas. Seleccione un diseño de impulsor y un motor para satisfacer la exRequisitos de mezcla. NOTA: Por ejemplo, un impulsor axial de baja cizalladura es una buena opción para algas Dunaliella , ya que carecen de una pared celular y pueden cortar fácilmente 11 . Estas algas tienen locomoción flagelar y no necesitan una mezcla intensa 11 . Bajas velocidades de mezclado se pueden lograr utilizando un mini-motor de 12 V. El impulsor y el eje pueden imprimirse en 3D (la información de impresión 3D se puede encontrar en la lista de materiales). Montar el cuerpo PBR y la tapa. Determine las dimensiones del reactor, basándose en los cálculos de volumen en el paso 1.1, teniendo en cuenta los objetivos experimentales y las limitaciones potenciales ( por ejemplo, el espacio). NOTA: Se prefiere un diseño de PBR con una proporción de superficie a volumen más baja, ya que esta forma minimiza la atenuación de la luz a través del PBR, proporcionando una distribución de luz más consistente a lo largo del experimento. Cortar cinco piezas de yeso opticamente transparenteHojas acrílicas (~ 0,25-0,5 pulgadas de espesor) utilizando una sierra de mesa, de acuerdo con el diseño PBR y tamaño establecido en el paso 1.3.1. Asegúrese de que los bordes de las juntas estén suavizados, pero no redondeados, utilizando papel de lija de 200 a 400 grados. Asegure los bordes de las piezas de acrílico junto con cinta y / o abrazaderas. NOTA: El cemento acrílico no es un pegamento. Si las superficies de unión acrílicas son ásperas o las piezas acrílicas no están uniformemente alineadas, este cemento de unión no será efectivo. En un área bien ventilada, aplique cemento acrílico a lo largo de las juntas con un dispensador de aguja. Las superficies de plástico se adhieren inmediatamente. Deje que las piezas se sienten durante 24 h. ADVERTENCIA: Se debe usar una máscara y guantes para evitar la inhalación y la exposición de la piel cuando se usa cemento acrílico. Aplique cemento acrílico viscoso a las juntas para asegurar que el PBR sea estanco. Dejar secar el cemento durante 24-48 h, de acuerdo con las instrucciones del cemento; Los tiempos de secado pueden variar. Llena laReactor con agua para verificar si hay fugas visibles. Si no hay fugas, coloque el reactor sobre toallas de papel y vuelva a verificar si hay señales de fugas después de 24-36 h. NOTA: Se deben usar láminas acrílicas no menos de ~ 0,5 de grosor para ensamblar PBRs que contienen más de ~ 2 L; Las hojas más delgadas pueden inclinarse bajo la presión del agua y causar fugas. Las juntas y los tornillos de refuerzo se pueden utilizar como una alternativa más robusta al cemento acrílico ( Figura 1 ). Este tipo de montaje requiere maquinaria de precisión y debe hacerse con extremo cuidado, ya que el acrílico puede romperse fácilmente. Utilice un taller de maquinaria para diseñar la tapa PBR, con puertos para acomodar sensores y otros accesorios y necesidades PBR ( ej. Impulsor, líneas de gas, puertos de muestreo, etc. ). Asegúrese de que los componentes internos no interfieran entre sí. NOTA: La configuración / diseño de la tapa PBR y PBR dependerá de los accesorios del reactor y de los objetivos experimentales. Ver Figura 1Para un ejemplo de reactor de PBR y diseño de tapa (se pueden encontrar más detalles en la sección de materiales). Este diseño PBR será referenciado para el resto del protocolo. Figura 1: Imagen de la configuración de PBR de escala de banco personalizada con sensores y un mezclador. Esta configuración muestra un mezclador, un electrodo asegurado a la tapa a través de un puerto roscado en la tapa, y un sensor de luz conectado a una tapa especialmente diseñada. Este diseño de tapa también incluye la fijación de un mini-motor de 12 V CC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 2. Configurar y configurar los sensores con la unidad de adquisición y control de datos NOTA: Los sensores traducen los cambiosEl mundo físico en una señal analógica medible, a menudo de voltaje. Las unidades de adquisición de datos sirven como interfaz entre el mundo físico y el digital y pueden utilizarse para leer estas señales analógicas y convertirlas en valores discretos, según las instrucciones de un ordenador. La unidad de adquisición de datos descrita en el presente documento tiene una resolución de entrada analógica de 16 bits, puede leer hasta 14 señales analógicas (± 10 V) y puede suministrar la potencia requerida por algunos sensores (hasta 5 V). Estas instrucciones proporcionan una visión general sobre cómo configurar esta unidad de adquisición y control de datos para convertir una señal analógica en valores más significativos para luz, pH y temperatura dentro de un PBR. Estas instrucciones no detallan conceptos importantes ( es decir , cuantificación, precisión, tiempo de respuesta, etc. ) necesarios para interpretar completamente estos valores medidos y para cuantificar la incertidumbre. <br/> Figura 2: Diagrama de conexión de la unidad de adquisición y control del sensor a la información. Este diagrama muestra cómo configurar sensores de pH, luz y temperatura en la unidad de adquisición y control de datos utilizada para este protocolo. Se muestran los componentes de procesamiento de señales para el pH y el sensor de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Configure y configure el sensor de luz con la unidad de adquisición y control de datos usando un filtro de paso bajo. NOTA: Consulte la Figura 2 para ver los diagramas de referencia generales. Las especificaciones del sensor del fabricante indican la diferencia entre los cables de señal, alimentación y tierra basados en el color. Un filtro de paso bajo es un circuito simple que utiliza una resistencia y un condensador para filtrar el ruido no deseado de las señales eléctricas. Este tipo de filtro atenúa las señales eléctricas con frecuencias más altas queN la frecuencia de corte determinada por la resistencia y la capacitancia. Este filtro ayuda a eliminar o suavizar el ruido eléctrico de la señal del sensor. Usando strippers del alambre, corte un pedazo del ~ 2 pulgadas del alambre verde del conector; Tira 0,25 pulgadas de aislamiento en un extremo y 0,5 pulgadas desde el otro extremo de ambas piezas. Identifique el cable de salida de señal analógica en el sensor de luz. Asegúrese de que por lo menos ~ 0.25-0.50 pulgadas de alambre de metal estén expuestos más allá del aislamiento del alambre. Cuidadosamente envolver una pierna de la resistencia de 1.000 Ω alrededor de la ~ 0,5 pulgadas despojado final del cable del conector. Envuelva la otra pata de la resistencia alrededor de la sección expuesta del cable de señal analógica del sensor de luz. Utilice un soldador y soldadura sin plomo para soldar las patas de la resistencia al alambre. Deje que la soldadura se enfríe durante 2-5 min. ADVERTENCIA: La soldadura y los hierros de soldadura se ponen extremadamente calientes y pueden ser muy peligrosos si los usuarios no están debidamente entrenados. Los videos instructivos se pueden encontrar en línea. Las gafas de seguridad y otras precauciones son extremadamente importantes. Los cables no deben conectarse a una fuente de alimentación u otros dispositivos durante este proceso. Deslice un pedazo de ~ 1,5 pulgadas de tubo de termorretráctil sobre un extremo del cable del conector y deslice la pieza hasta que cubra el alambre soldado y la resistencia. Asegúrese de que todas las piezas de metal estén completamente cubiertas. Caliente con una pistola de calor. Asegúrese de que el tubo se enrolla firmemente alrededor de la resistencia y los cables; Ningún alambre desnudo debe estar expuesto. Conecte el cable de tierra del sensor de luz a un terminal de masa libre (GND) en la unidad de adquisición y control de datos usando un destornillador. Asegure el extremo libre del cable del conector de señal a un terminal de entrada analógica libre (AIN) usando un destornillador. Asegure el cable positivo del condensador de 1.000 μF ( es decir, la pata más larga) al mismo terminal AIN que en el paso 2.1.8 y el cable negativo ( es decir, la pata más corta) al mismo terminal GND que en el paso 2.1.7.Asegúrese de que tanto la perna del condensador como el cable estén firmemente conectados al terminal. Identifique el cable de entrada de energía para el sensor de luz y asegure este cable a un terminal de suministro de tensión (VS) en la unidad de adquisición y control de datos. Configure y configure el electrodo de pH con la unidad de adquisición de datos utilizando un amplificador de ganancia unitaria y un filtro de paso bajo. NOTA: Debido a la naturaleza de las mediciones de pH ( es decir , alta impedancia y baja tensión), a menudo se requiere un búfer de amplificación de ganancia unitaria entre la sonda de pH y el dispositivo de adquisición de datos. Un filtro de paso bajo también es beneficioso para medir el pH, para proteger la señal del ruido eléctrico ambiental. Conecte el amplificador de ganancia unitaria a la sonda de pH utilizando el cable del transmisor. Conecte el adaptador coaxial, con terminales de puerto positivo y negativo, al otro extremo del amplificador de ganancia unitaria. Cortar dos piezas de 6 pulgadas de verde y una pieza de 12 pulgadasE de alambre de conector negro utilizando strippers de alambre. Tira 0,25 pulgadas de aislamiento de ambos extremos del cable conector negro. Tira 0.25 pulgadas y ~ 0.5 pulgadas de aislamiento de los extremos de los cables de conector verde utilizando strippers de alambre. Cuidadosamente envolver una pierna de la resistencia de 1.000 Ω alrededor de la sección de ~ 0,5 pulgadas pelado de un cable de conector verde. Envuelva la otra pierna de la resistencia alrededor de la sección de ~ 0,5 pulgadas pelado del otro cable conector verde. Utilice un soldador y soldadura sin plomo para soldar las patas de la resistencia al alambre. Deje que la soldadura se enfríe durante 2-5 min. Deslice un pedazo de ~ 1,5 pulgadas de tubo de termorretráctil sobre un extremo del cable del conector y deslice la pieza hasta que cubra el alambre soldado y la resistencia. Asegúrese de que todas las piezas de metal estén completamente cubiertas. Caliente con una pistola de calor. Asegúrese de que el plástico se envuelve firmemente alrededor de la resistencia y los cables; Ningún alambre desnudo debe estar expuesto. Asegure un extremo del negro cOnnector al poste de borne negativo (negro) en el adaptador coaxial. Inserte el otro extremo de este cable en un terminal GND de la unidad de adquisición y control de datos y asegúrelo con un destornillador. Asegure un extremo del cable conector verde (con la resistencia en serie) al borne positivo (rojo) del adaptador coaxial. Inserte el otro extremo de este cable conector en un terminal AIN libre en la unidad de adquisición y control de datos. Identificar el cable positivo del condensador de 1.000 μF ( es decir , la pata más larga) y asegurar este cable al mismo terminal AIN como en el paso 2.2.9; Asegúrese de que la pata del condensador y el cable de señal estén firmemente conectados al terminal. Asegure el cable negativo del condensador de 1.000 μF ( es decir , la pata más corta) al mismo terminal GND que en el paso 2.2.8. Conecte el sensor de temperatura a la unidad de adquisición y control de datos conectando la señal, tierra y potencia wDe la sonda para liberar terminales AIN, GND y VS. 3. Configure la adquisición de datos en vivo y el archivo experimental NOTA: El software de adquisición y control de datos descrito aquí se comunica con la unidad de adquisición y control de datos para monitorear y registrar los datos del sensor a intervalos de tiempo especificados por el usuario. Las instrucciones siguientes explican cómo configurar un archivo de control en este software para supervisar y registrar el pH, la temperatura y la luz. Estas instrucciones son específicas para el software y la unidad de adquisición y control de datos enumerados en la sección de materiales. Encontrará más instrucciones en los manuales de usuario del producto. Conecte la unidad de adquisición y control de datos a un ordenador cerca de la instalación experimental utilizando un cable USB y descargue todos los controladores necesarios. Descargue y abra el software de adquisición y control de datos. Configure "Conversiones" para cada sensor en el software. NOTA: Para convertir el volt físicoEdad en un valor significativo, se debe aplicar algún factor de conversión, establecido por la calibración. Muchos sensores vienen con factores de calibración de fábrica que se encuentran dentro de las hojas de especificaciones específicas del producto. Las ecuaciones de conversión son específicas para la configuración y los sensores. Muchos parámetros de la ecuación de conversión, especialmente los de los electrodos, deben ser actualizados regularmente a través de la calibración. La vida útil de un sensor y la frecuencia de calibración dependerán de las especificaciones específicas del producto y del entorno de trabajo. NOTA: Los usuarios deben leer y comprender estas especificaciones en su totalidad. La Tabla 1 muestra las conversiones de los sensores que se encuentran en la lista de materiales. A continuación se muestra un ejemplo de conversión para la sonda de temperatura. Navegue hasta "Conversiones" en el área de trabajo del software, en el lado derecho de la página principal. Agregue un nombre de conversión, como "volts_to_celsius" y escriba la ecuación de conversión: (55.56 x valor) + 255.37 – 273.15. Nombre del Canal Nombre de la conversión Ecuación Notas Temperatura Volts_to_celsius (55,56 x valor) + 255,37 – 273,15 Ecuación de conversión del fabricante para convertir voltios en centímetros cúbicos. Ligero Volts_to_PPFD Valor x 500 Factor de conversión del fabricante para convertir voltios a densidad de flujo de fotones fotosintéticos (μmol m -2 s -1 ), fabricante de corrección de LED no se aplica. PH Volts_to_pH (Valor de -17,05 x) + 6,93 Ecuación de conversión dependiente de la calibración (Figura 4b) para convertir lecturas de voltaje de electrodo de pH en valores de pH. Aplicar sólo la conversión al canal de pH aDespués de la calibración. Tabla 1: Tabla de conversión de canales para el archivo de adquisición de datos. Ejemplos de cómo introducir información de canal y conversión para los sensores en el software de adquisición de datos. Configure los canales adecuados para cada sensor dentro del software para adquirir los datos del sensor. NOTA: Cada sensor necesita su propio canal analógico a digital en el software y un terminal de entrada analógico designado dentro de la unidad de adquisición y control de datos. Navegue hasta la página "Canal" dentro del software. Agregue un nombre de canal del sensor. No se permiten caracteres de espacio. Seleccione el dispositivo apropiado para recopilar datos para el canal correspondiente; Este dispositivo corresponderá al dispositivo de adquisición de datos. Introduzca el número de dispositivo utilizado para referenciar la unidad de adquisición y control deDispositivo de adquisición de datos; Si sólo se utiliza una unidad, el número predeterminado es a menudo cero. Seleccione "analógico a digital", "A a D" para el tipo de entrada-salida ("Tipo E / S") e ingrese el número de canal que corresponde al número de terminal AIN en la unidad de adquisición y control de datos Introduzca el muestreo deseado "Timing" (s); Este valor indica la frecuencia con que se leerá la señal del sensor. Entrada 1.0 para adquirir una lectura cada 1 s. Para calcular el promedio de los datos en intervalos de 1 minuto antes del registro, marque la casilla "Avg" y especifique 60 para la longitud del promedio. Seleccione la conversión adecuada en el menú desplegable, si corresponde (consulte el paso 3.3 para generar conversiones); De lo contrario, todos los datos del canal se mostrarán / grabarán como voltaje. Configure el "Logging Set" para registrar los datos experimentales. Navegue hasta el "Panel de registro" dentro del área de trabajo del software,Ew conjunto de registro, y el nombre del conjunto en consecuencia. Seleccione el tipo de archivo de salida y la ubicación; El tipo de archivo ASCII proporcionará un archivo de valores separados por comas si la extensión '.csv' se especifica en el nombre del archivo de salida. Agregue todos los canales deseados para iniciar sesión en este conjunto. Inicie y deje de registrar como desee haciendo clic derecho en la secuencia de registro en el área de trabajo y seleccionando la opción apropiada. NOTA: No intente acceder al archivo cuando se registran activamente datos. Esta acción puede interrumpir el proceso de registro. La ubicación del archivo para los archivos registrados continuamente no se debe guardar / escribir en un directorio en la nube. Configurar la "Página" para mostrar los datos y gráficos. Navegue hasta la pantalla "Páginas" dentro del área de trabajo del software. Haga clic en una de las páginas en blanco predeterminadas. Para mostrar numéricamente la lectura de la salida de un sensor en la página, añada una pantalla de "Valor variable" a la página. AparejoHt-click en cualquier lugar dentro de la página en blanco, seleccione "Muestra" y haga clic en la opción "Valor de la variable"; Una pequeña caja aparecerá en la pantalla. Haga clic con el botón derecho en este cuadro recién creado y seleccione "Propiedades". Escriba el subtítulo de la pantalla (por ejemplo, "Temperatura en el Reactor"), la referencia del canal (por ejemplo, "Temperatura [0]") y las unidades asociadas (por ejemplo, "Celsius"). Haga clic en "Aceptar" y volver a la página de visualización. Para visualizar los datos del sensor gráficamente y en tiempo real, agregue un gráfico 2D a la página de visualización. Haga clic con el botón derecho en cualquier lugar dentro de la página en blanco y seleccione "Gráficos" y luego "Gráficos 2-D"; Una pequeña parcela aparecerá en la pantalla. Haga clic con el botón derecho en el gráfico recién creado y seleccione "Propiedades". En la pestaña "Trazas", escriba el nombre del canal de sensor deseado (por ejemplo, "Temperatura") en el cuadro para "Expresión Y" y asegúrese de que "Tiempo" esté escritoN en el cuadro para "X Expresión :." Haga clic en "Aceptar" y volver a la página de visualización. 4. Calibrar la sonda de pH NOTA: La calibración del pH debe realizarse antes de cada experimento, a la temperatura de experimentación deseada, y las conversiones del canal de pH deben actualizarse en consecuencia. Las lecturas de los electrodos de pH pueden desviarse durante los experimentos; Para determinar el alcance de esta deriva, repetir el proceso de calibración después de ejecutar la configuración experimental y comparar las lecturas. Los electrodos de pH deben almacenarse adecuadamente en la solución de almacenamiento adecuada antes y después de la experimentación, según las indicaciones del fabricante. Conecte los sensores de pH y temperatura, como se describe en el paso 2. Inserte el electrodo de pH y la sonda de temperatura en el tampón de calibración de pH 7. Compruebe la pantalla gráfica para asegurarse de que la lectura de la temperatura de la sonda esté a la temperatura deseadaPara experimentos de ejecución (paso 3.6.2.2). Deje que la salida del voltaje del electrodo de pH se estabilice ( es decir, las lecturas de voltaje ya no cambian en una dirección). Utilice una pantalla gráfica para confirmar la estabilización. Registre los datos eléctricos de temperatura y pH en un archivo (paso 3.5) durante 30-60 s. Durante este proceso, el canal de pH no debe tener ninguna conversión aplicada ni incluir ningún promedio. Nota: Dado que los electrodos de pH son sensibles al ruido eléctrico, puede ser preferible un menor tiempo de adquisición (es decir, un muestreo más rápido) para el canal de pH ( por ejemplo, 'Temporización' = 0,1 s). Tenga en cuenta que un menor tiempo requerirá más recursos computacionales. Repita la calibración para los tampones 4 y 10. Confirme que la respuesta del sensor esté entre -57 y -59 mV / pH ( Figura 3a ). Generar una ecuación de conversión trazando el valor del buffer de pH en función del voltaje y ajustando una línea ( Figura 3b </strong >). Actualice la ecuación de conversión como se describe en el paso 3.3. Aplique esta conversión al canal de pH y actualice la configuración del canal para incluir el promedio como se desee para el registro. 5. Configurar el PBR para el experimento de algas NOTA: Los pasos a continuación son específicos de Dunaliella y el PBR personalizado que se muestra en la Figura 1 . Además, estas instrucciones de configuración no están de acuerdo con los protocolos estériles, ya que este sistema no fue diseñado de tal manera. Preparar el inóculo de algas y el medio de crecimiento, según sea necesario para el experimento y los objetivos experimentales. Conecte los hilos de pH y temperatura a la unidad de adquisición y control de datos, como se describe en los pasos 2.2-2.3. Calibrar y actualizar la ecuación de conversión para el canal de pH , como se describe en los pasos 3.3 y 4. Igimg "src =" / files / ftp_upload / 55545 / 55545fig4.jpg "/> Figura 4: Diagrama de cableado del mezclador. Este diagrama muestra cómo configurar un dispositivo mezclador para un PBR usando un mini-motor de engranajes, una fuente de alimentación y un impulsor y eje impreso 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Configure el PBR dentro de una incubadora de temperatura controlada con accesorios y sensores. Consulte la Figura 4 para la visualización. Configure el sensor de luz dentro del PBR enhebrando el cable del sensor de luz a través del puerto de la tapa y luego montando el cabezal del sensor en el soporte de la extensión de la tapa utilizando el tornillo suministrado. Utilice un tapón de goma o un ojal para mantener este puerto cerrado a la atmósfera. Fije y asegure el impulsor del mezclador sobre la tapa de PBR colocando el eje del impulsor sobre el mini-engranaje de la CCEje dentro de la tapa PBR; Asegure el eje con un tornillo de fijación y una llave Allen. Agregue el medio de crecimiento específico de las algas, coloque la tapa y asegure la tapa con tornillos. Coloque el PBR dentro de la incubadora (ajuste a 25 ° C oa la temperatura deseada). Inserte la sonda de temperatura en su puerto designado y asegúrelo en el puerto usando un tapón de goma. Asegure la sonda de pH en el puerto de la tapa del reactor usando un montaje roscado PG-13.5. Conecte los cables del sensor de luz a la unidad de adquisición de datos, como se describe en el paso 2.1. Encender el impulsor del mezclador a la velocidad deseada. Configure la fuente de alimentación de CC variable adyacente a la configuración. Encienda la fuente de alimentación y ajuste el mando de voltaje hasta que el valor de voltaje indique 0 voltios. Apague la fuente de alimentación. Conecte las líneas de potencia del motor del impulsor a los terminales de salida positiva y negativa de la fuente de alimentación variable ( Figura 5 </stroNg>). ADVERTENCIA: Nunca conecte o toque cables o circuitos activos. Asegúrese de que todas las fuentes de alimentación estén apagadas antes de conectar los cables. Siempre lea las instrucciones / especificaciones del fabricante para asegurar la compatibilidad entre el motor, la fuente de alimentación y los cables. Encienda la fuente de alimentación y aumente lentamente el voltaje girando el mando de voltaje hasta alcanzar la velocidad de mezcla deseada; Calcular la velocidad de mezcla midiendo las rotaciones por minuto. Figura 5: Diagrama de configuración experimental del reactor. Visualización de una configuración experimental de PBR en una incubadora con temperatura controlada. Esta configuración incluye una lámpara de crecimiento y un PBR, con sensores y un mezclador asegurado dentro de la tapa PBR. Haga clic aquí paraVer una versión más grande de esta figura. Coloque la lámpara de crecimiento para iluminar el PBR. NOTA: Se eligió una lámpara de LED de alta potencia que emite en el espectro azul y rojo para lograr los niveles de intensidad de luz fotossintética requeridos para esta investigación específica de Dunaliella. El tamaño y la forma del accesorio de luz deben seleccionarse de tal manera que la luz ilumine uniformemente la superficie incidente del PBR. Verifique que la incubadora pueda manejar una fuente de calor interna. No hacerlo podría acortar la vida útil de la incubadora y / o podría causar daños o calentamiento excesivo dentro de la incubadora. Centrar la lámpara de crecimiento a lo largo de la cara frontal del PBR. Asegúrese de que la trayectoria de la luz esté orientada directamente hacia el sensor de luz montado en la parte posterior del reactor. Encienda la luz y ajuste la intensidad de la luz según sea necesario moviendo la lámpara de crecimiento directamente hacia o lejos del reactor. Compruebe la indicación de la variable del sensorLecturas Vigile y registre los datos del sensor durante 6 – 24 h para asegurarse de que la luz, la temperatura y las lecturas de pH dentro de la PBR son estables y dentro del rango deseado. Ajuste según sea necesario. NOTA: El ruido eléctrico puede observarse a menudo mediante saltos, lecturas inestables y / o cambios abruptos en los valores, sin cambios aparentes en el ambiente de PBR. Retire el tapón de goma en el puerto de muestreo para agregar el inóculo de algas a través de la pipeta de transferencia. Retire las muestras y vigile las condiciones para asegurarse de que permanecen dentro del rango deseado para el experimento. Eliminar los cultivos para el análisis según sea necesario desde el puerto de muestreo con una pipeta. NOTA: El volumen de la muestra, la frecuencia y la duración del experimento dependerán del paso 1.1.2. Controle la temperatura del agua dentro del PBR verificando la visualización de datos en el software y ajustando manualmente el punto de ajuste de la temperatura del aire del incubador para mantener el tempe de aguaConstante constante. NOTA: Este ajuste dependerá de las instrucciones del fabricante de la incubadora. Controlar y ajustar el pH dentro de la PBR, como se desea, para asegurar que el pH se mantiene dentro del rango esperado para los experimentos. NOTA: Aquí, el pH se controló con una válvula solenoide de 12 V (normalmente cerrada) en línea con un tanque de CO2 comprimido (99,99%). La válvula se abrió según se requirió utilizando la funcionalidad de control de la unidad de adquisición y control de datos y el software. Esta configuración requirió una placa de relé de accesorios y módulos de CC y se implementó utilizando programación de computadora personalizada adaptada a objetivos de investigación específicos.

Representative Results

Los datos de este sistema de monitoreo en tiempo real muestran el ambiente de cultivo dinámico para algas dentro de un PBR de escala de banco y destacan la necesidad de monitorear y controlar el sistema. Los datos de temperatura registrados ( Figura 6 ) demuestran cómo la iluminación de la luz, la temperatura del aire del incubador y la disipación de energía asociada con el crecimiento de algas pueden cambiar la temperatura dentro del PBR y cómo los datos en tiempo real pueden usarse para ajustar los controles de temperatura de la incubadora. La luz medida durante el transcurso del experimento enfatiza aún más la naturaleza dinámica de este entorno en crecimiento. Como se observa en la Figura 7 , la lectura del sensor de luz, medida como densidad de flujo de fotones fotosintéticos (PPFD: μE-m -2 s -1 ), fue de ~ 100 PPFD antes de que se añadieran las algas y se redujo de inmediato a 85 PPFD afInoculando el reactor con el cultivo de algas. La disminución de la intensidad de la luz se debe al aumento de la biomasa y el recuento celular, y / o al aumento de la absorción por el aumento del contenido de clorofila, lo que demuestra que las algas están activas hasta el día 7, a pesar de la baja Niveles de luz. Se requieren medidas biológicas adicionales para hacer inferencias adicionales. Los datos de pH registrados continuamente muestran que, en general, el pH se controló adecuadamente durante este experimento con el algoritmo de control de pH implementado ( Figura 8 ). Estos datos, que muestran las lecturas minuto a minuto y los promedios de una hora, demuestran algunos puntos clave sobre el cultivo de algas y el control del pH en tiempo real. En primer lugar, el pH aumentó por encima del punto de ajuste deseado de 7,6 inmediatamente después de inocular el PBR con algas. Este cambio se esperaba, ya que la semilla de cultivo que se agregó a la PBR habíaH mayor que el punto de referencia, puesto que el matraz usado para hacer crecer el inóculo no estaba controlado por el pH. En segundo lugar, estos datos en vivo resaltan la sensibilidad de los electrodos de pH al ruido eléctrico externo. Esta sensibilidad se observa por un salto drástico en los valores del electrodo entre el día 1 y el día 2. Estos cambios repentinos en los valores de pH fueron creados probablemente por el ruido eléctrico de una electroválvula de una disposición experimental adyacente. Esta perturbación eléctrica desencadenó prematuramente el algoritmo de control de pH para inyectar CO 2 en el PBR. En consecuencia, el pH bajó por debajo del punto de ajuste deseado. La sensibilidad de los electrodos de pH puede conducir a extremos extremos y puede potencialmente interrumpir los sistemas de control. Figura 3: Gráficos de ejemplo de respuesta y calibración de pH. (A) Ejemplo de gráfico de respuesta deE Sensor de pH ( b ) Ejemplo de gráfica de calibración del sensor de pH, con una ecuación a utilizar para la conversión. El análisis de regresión muestra un intervalo de confianza del 95%. Las barras de error no son visibles (error estándar inferior al 0,03%). Estos gráficos muestran que los sensores de pH estaban conectados correctamente y que su señal era muy estable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Mediciones de temperatura dentro del PBR durante un experimento de 7 días. Los puntos azul oscuro representan medias de 1 h de los datos del sensor y los puntos azules claros representan las lecturas del sensor adquiridas durante 1 minuto (tiempo de adquisición de 1 s, longitud media de 60) y se convierten a temperatura utilizando factores de conversión suministrados por el fabricante. Flechas negras sho W cuando el ajuste de la temperatura de la incubadora se ajustó para mantener la temperatura del cultivo alrededor de 25ºC (este punto de ajuste deseado se designa con una línea roja punteada). Las fluctuaciones de la temperatura se deben al crecimiento de las algas y cambios en la temperatura de la incubadora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Mediciones de luz dentro del PBR durante un experimento de 7 días. Los puntos azul oscuro representan las medias de 1 h de los datos del sensor y los puntos azules claros representan las lecturas del sensor adquiridas durante 1 minuto (tiempo de adquisición de 1 s, longitud promedio de 60) y convertidas en PPFD usando valores predeterminados de calibración de fábrica del sensor de luz."> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Mediciones de pH dentro del PBR durante un experimento de 7 días. Los puntos azules oscuros representan medias de 1 h de los datos del sensor y los puntos azules claros representan lecturas del sensor registradas cada 1 min (tiempo de adquisición de 0,1 s, longitud promedio de 600) y convertidas en pH usando la ecuación de conversión establecida mediante calibración. El pH se mantuvo entre 7,6 y 7,5 usando una inyección de gas de CO $ ₂ $ al 99%. Las líneas rojas punteadas indican el rango de pH deseado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este sistema PBR ofrece la capacidad de monitorear y controlar los experimentos de crecimiento cinético de algas a escala de banco, permitiendo resultados más repetibles a partir de ensayos experimentales usados para cuantificar el crecimiento. Sin embargo, una comprensión de las limitaciones e incertidumbres de las mediciones del sensor es crítica para asegurar que las lecturas del sensor reflejen con precisión las condiciones del reactor. Esta comprensión incluye el conocimiento básico de los principios de medición involucrados con los sensores, el proceso y la frecuencia de calibración, la incertidumbre de medición y lo que el sensor puede y no puede medir. Por ejemplo, la respuesta eléctrica para el sensor de luz descrito aquí no está distribuida equitativamente a través del espectro visible, y pueden ser necesarios ciertos factores de corrección a la salida del sensor, dependiendo de cómo se analizarán estos datos del sensor.

Los niveles de temperatura y las variaciones también son extremadamente importantes, ya que los cambios de temperaturaLa respuesta del sensor. La comprensión de las interferencias potenciales que pueden afectar las lecturas del sensor también es de importancia crítica; Esta interferencia puede ser el ruido eléctrico ambiental del edificio o podría provenir del entorno de medición ( por ejemplo, los iones de sodio pueden afectar drásticamente las lecturas de pH a valores de pH superiores a 10) ¹² . Además, sumergir múltiples sondas en una solución, especialmente una solución de sal altamente iónica y conductora, es también una fuente potencial de interferencia. Los electrodos que miden el pH (o fuerza iónica, oxígeno disuelto, CO ₂ disuelto, etc. ) son especialmente sensibles al ruido eléctrico ambiental y pueden ser fácilmente perturbados. El acondicionamiento de la señal utilizado para proteger la señal del electrodo no puede garantizar que otros factores no interfieran con las lecturas de la sonda. Como parte del control de calidad, se debe utilizar otro equipo de laboratorio, como una sonda de pH portátil, un espectrómetro de mano y un termómetro, para verificarLas lecturas del sensor y para asegurarse de que el sistema está configurado y funcionando correctamente.

Otra limitación que debe abordarse es el posible impacto de las algas y / o el entorno de cultivo en los sensores. Por ejemplo, si los restos de algas o las burbujas cubren el receptor del fotodiodo del sensor de luz, las lecturas serán afectadas. Del mismo modo, los electrodos de pH son extremadamente sensibles y requieren un cuidado extra para garantizar lecturas precisas. Estos electrodos funcionan midiendo una diferencia de voltaje a través de una unión interna debido a la acumulación de iones H ⁺ ; Se requiere una capa amortiguadora hidratada dentro de la sonda para mantener mediciones precisas ¹² . Dependiendo de las condiciones dentro del reactor, esta capa se desgastará, y la respuesta del sensor puede cambiar durante el curso del experimento mientras la sonda está sumergida. En ensayos preliminares, la salida de voltaje de pH no se desplazó en más de ~ 0,2 unidades de pH durante el transcurso de un experimento de 20 días, Pero se deben realizar más evaluaciones para caracterizar este cambio en la respuesta del sensor y establecer tiempos máximos de ejecución experimental, especialmente si se necesitan ajustes / cuantificaciones de pH fino.

Muchos de los actuales sistemas de PBR diseñados para analizar el crecimiento de las algas no monitorean y controlan el ambiente de cultivo interno tan fuertemente como sea necesario para discernir cómo influyen los diferentes factores en el crecimiento de las algas, ya que establecer sistemas de esta manera puede ser un desafío. Este protocolo puede ayudar a facilitar más experimentos controlados dando instrucciones paso a paso para construir un PBR con monitoreo en tiempo real. Además, estos datos vivos pueden utilizarse no sólo para un mejor control de las condiciones experimentales, sino que pueden utilizarse para estimar la cinética de crecimiento ( por ejemplo, lecturas de densidad óptica como referencia para las tasas de crecimiento generales).

Los sistemas experimentales controlados pueden ayudar a que la investigación de algas sea más reproducible. PBR de escala de bancoLos etups que son monitoreados y controlados pueden aumentar la eficiencia experimental minimizando artefactos no deseados en el diseño experimental y pueden ayudar a avanzar los esfuerzos para hacer de los biocombustibles de algas una fuente de combustible sostenible y alternativa.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen a la Fundación Nacional de Ciencias Fronteras Emergentes en Investigación e Innovación (Premio # 1332341) por financiar esta investigación. Los autores también desean agradecer al Dr. Andrew Grieshop, así como a las comunidades de apoyo en línea de LabJack y DAQFactory por su asistencia y ayuda ofrecidas a lo largo de este proceso.

Materials

Cast acrylic sheets	McMaster Carr	8560K244	7/8'' thick, 12×36'', optically-clear, the size of sheets purchased will depend on reactor dimensions.
Acrylic cement	McMaster Carr	7517A4	Scigrip plastic pipe cement, #4SC nonwhitening for acrylic. Not needed if gaskets and screws are used for PBR assembly.
Acrylic cement applicator needle	McMaster Carr	75165A136	Acrylic cement applicator needle, 25 Gauge, 1", Stainless steel, PTFE lined.
Plastic dispensing bottle for acrylic cement	McMaster Carr	7544A67	Plastic dispensing bottle, 2-oz size, packs of 5.
Viscous acrylic cement	McMaster Carr	7515A11	Scigrip plastic pipe cement. Medium-bodied acrylic cement to seal in any gaps within PBR body.
PG-13.5 thread tap	McMaster Carr	2485A14	Can be used to help secure pH electrode to lid (if applicable).
PBR and lid	NCSU Precision Machine Shop	Karam Algae 3.2L Reactor Revision E	This machine shop is open to public for business. Contact shop manager.
pH sensor	Hamilton	238643	EasyFerm Plus 120, autoclavable, millivolt output.
Light sensor	Apogee Instruments	SQ-225	Amplified 0-5 volt electric calibration quantum sensor, water-proof.
Temperature sensor	LabJack	EI1034	Stainless steel, water-proof temperature sensor.
pH transmitter wire with BNC end	Sigma-Aldrich	HAM355173-1EA	This wire will vary with type of pH probe. Make sure wire is compatible with pH probe and has BNC connector end.
Unity gain pre-amplifier	Omega Engineering	PHTX-21	Signal processing amplifier for pH electrode needed for high-impedance pH readings.
Coaxial adapter, BNC female-to-binding post	Amazon	SMAKN B00NGD5K80	For connecting pH signal from pre-amplifier to microcontroller.
Capacitor (1000 uF)	Amazon	Nichicon BCBI4950	For low-pass filter.
Resistor (1000 ohm)	Radio Shack	2711321	For low-pass filter.
Hookup wire	RadioShack	2781222	For making low-pass filters, connecting sensors to microcontroller, and wiring motor.
Heat shrink tubing	RadioShack	2781611	For low-pass filter assembly.
Data acquisition and control unit	LabJack	LabJack U6	To process electrical signal from sensors and communicate with data acquisition and control software.
DAQFactory data acquisition software	DAQFactory	DAQFactory Express Release 5.87c Build: 2050	Free to download, for up to 10 channels.
Mini DC-gearmotor	McMaster Carr	6331K31	Motor for mixer impeller.
Impeller and shaft	N/A	N/A	Email authors for 3D files.
Variable DC power supply	Amazon	Tekpower HY1803D	Variable DC power supply, 0-18V @ 0-3A.
Grow Lamp	HydroGrow	SOL-1	This exact model is no longer available.
Incubator	Thermo Scientific	Precision Model 818	This particular incubator can withstand an internal heat source since this unit's cooling compressors run non-stop regardless of temperature setting.

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Cite This Article

Karam, A. L., McMillan, C. C., Lai, Y., de los Reyes III, F. L., Sederoff, H. W., Grunden, A. M., Ranjithan, R. S., Levis, J. W., Ducoste, J. J. Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests. J. Vis. Exp. (124), e55545, doi:10.3791/55545 (2017).

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