Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled
Summary
קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.
Abstract
קינאזות חלבונים מסוגלים לשלוט בשינויים תאיים בקנה מידה גדול בתגובה למערכים מורכבים של גירויים, ומאמץ רב הופנה לחשוף פרטים אלסטריים של הרגולציה שלהם. קינאזות הן רשתות איתות אשר פגמים הם לעתים קרובות סימני ההיכר של צורות רבות של סרטן ומחלות נלוות, מה שהופך פלטפורמת assay מקובל מניפולציה של גורמים רגולטוריים במעלה הזרם ואת האימות של דרישות התגובה קריטי בחיפוש אחר טיפול משופר. כאן, אנו מתארים assay קינאז בסיסי שניתן להתאים בקלות כדי להתאים שאלות ניסיוניות ספציפיות, כולל אך לא מוגבל לבדיקת ההשפעות של סוכני ביוכימי ופרמקולוגי, מניפולציות גנטיות כגון מוטציה ומחיקה, כמו גם התנאים תרבות התא וטיפולים בדיקה מנגנוני איתות תא. Assay זה מנצל radiolabeled [γ- 32 P] ATP, המאפשר השוואות כמותיות הדמיה ברורה של התוצאות, והוא יכול להיות modאם נעשה שימוש עם קינאז immunoprecipitated או רקומביננטי, מצעים ספציפיים או מאופיינים, בכל רחבי מגוון רחב של תנאי תגובה.
Introduction
קינאזות חלבון הן אנזימים מתוחכמים קריטיים להעברת אותות סלולריים לתגובות הולמות 1 . בהתחשב בתפקידים שלהם בשמירה על הומאוסטזיס ומניעה או קידום של מצבי מחלה 2 , שיטות ביוכימיות להערכת פעילות קינאז ממשיכות להיות כלים רבי עוצמה לתיאור הפרטים של איתות אוקריוטי 3 . למרות אסטרטגיות ניצול נוגדנים ספציפיים phospho כבר אינפורמטיבי מאוד במונחים של מדידת ההשפעות של תנאי טיפול שונים על מצב איתות תא 4 , assay קינאז מאפשר למדוד את ההשפעות של תנאי טיפול שונים ישירות במונחים של פעילות אנזימטית של קינאז של ריבית. אמנם יש מספר אפשרויות עבור מבחני דומים שאינם משתמשים בחומרים רדיואקטיביים 5 , אנו ממשיכים להסתמך על שיטה זו quantitation חזק של תוצאות. שםהם שני יישומים טיפוסיים של assay זה, שניהם בעלי ערך מסיבות שונות: assay immunoprecipitated (IP) קינאז ( איור 1 ) ואת assay חלבון רקומביננטי קינאז ( איור 2 ).
Assay IP Kinase הוא שימושי מאוד עבור זיהוי גורמים המסוגלים להפעיל קינאזות חלבון ספציפיים, כמו גם לאמוד תנאי טיפול מעכב. בקצרה, קינאז אפיטופ מתויג של עניין הוא transfected לתאי eukaryotic תרבותי, נתון למגוון של טיפולים, immunoprecipitated, assayed על היכולת לשלב פוספט radiolabeled לתוך מצע מודל ( למשל myelin בסיסי חלבון (MBP)). Assay IP kinase יכול להתבצע גם מבלי להזדקק overexpression, או על ידי immunoprecipitation של חלבון אנדוגני או כל מספר של טכניקות עריכת הגנום. בגלל טיפולים מנוהלים בתרבות, שיטה זו יכולה לזהות גירויים המועברים באמצעות גורמים במעלה מרוביםאו מסלולים מקבילים על ידי readout במבחנה . אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו היא כי היא אינה דורשת ידע מוקדם של גורמים במעלה או במורד הזרם ישיר או אתרי זרחן בו. יתר על כן, לאחר מצעים ספציפיים עבור קינאז של עניין זוהו, אותו פרוטוקול assay קינאז ניתן להשתמש עם רכיבים רקומביננטי למדוד פעילות ספציפית כלפי מצעים טבעיים לזהות אתרי זרחן ספציפיים בשילוב עם ניתוח ספקטרומטריית מסה. אתרים המזוהים בצורה זו ניתן לאמת עוד עם מבחני קינאז ניצול מוטציות המצע. לבסוף, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לזהות ולמדוד autophosphorylation.
פרוטוקול בתנאי כאן מניח או מטוהרים חלבון אופטימיזציה או שיטת transfection להביע קינאז מתויג זיקה של עניין בתרבית תאים. לקבלת תערוכות מפורטות יותר של transfection, תמוגה, immunoprecipitation, ואת חלבון טיהור מגןOcols, אנו מציעים להתייחס פרוטוקול הקרה האביב הארבור 6 . לקבלת מידע נוסף לגבי פיתוח assay ושינוי, עיין פרוטאין זרחון: שיטות נבחרות אנזימולוגיה 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
קינאזות הם משפחה מגוונת של חלבונים אשר התפתחו פונקציונליות נרחבת בהקשרים רבים, מבחני קינאז כבר שימושי מאוד בחקר חלבונים איתות כמה תרמו רבות להבנתנו הנוכחית של התקשורת הסלולרית. יש לציין, אותו assay הבסיסי שימש אפיון שני קינאזות שונות למרות הבדלים גדולים במבנה ופעילות….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לכל החברים הנוכחיים והעברתיים של מעבדת קוב עבור עבודה ודיונים יקרי ערך, ו Dionne Ware עבור סיוע מנהלי. מחקרים אלה נתמכו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט R37 DK34128 ו Welch קרן גרנט I1243 ל MHC
Materials
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
| BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
| BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
| BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
- Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
- Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).
- Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).
- Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).
- . Autoradiography Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011)
- Walker, J. M. . The Protein Protocols Handbook. , (2009).
- Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).
- McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).
- Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).
- Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
- Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).
