放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

プロテインキナーゼは、細胞シグナルの適切な応答への伝達に不可欠な洗練された酵素である¹ 。ホメオスタシスの維持と病態²の予防または促進における役割を考えると、キナーゼ活性を評価するための生化学的方法は、真核生物のシグナル伝達の詳細を描写するための強力なツールであり続けている³ 。リン酸化特異的抗体を用いる戦略は、細胞シグナル伝達状態⁴に対する異なる治療条件の影響を測定する点で非常に有益であるが、キナーゼアッセイは、異なるキナーゼのキナーゼの酵素活性に関して異なる治療条件の影響を直接測定することを可能にする。関心放射性物質^5を使用しない類似のアッセイにはいくつかの選択肢がありますが、我々は結果の堅牢な定量化のためにこの方法に引き続き依存しています。そこ免疫沈降（IP）キナーゼアッセイ（ 図1 ）および組換えタンパク質キナーゼアッセイ（ 図2 ）の2つの典型的な用途である。

IPキナーゼアッセイは、特定のプロテインキナーゼを活性化することができる因子ならびにゲノム阻害性の治療条件を同定するために非常に有用である。簡潔には、目的のエピトープタグ化キナーゼを培養真核細胞にトランスフェクションし、種々の処理を施し、免疫沈降させ、放射性標識ホスフェートをモデル基質（ 例えば、ミエリン塩基性タンパク質（MBP））に取り込む能力についてアッセイする。 IPキナーゼアッセイはまた、内因性タンパク質の免疫沈降または任意の数のゲノム編集技術のいずれかによって、過剰発現に頼らずに行うことができる。治療は培養で行われるので、この方法は複数の上流因子を介して伝達される刺激を検出することができるまたはインビトロでの読取りによる並行経路である 。この方法の1つの大きな利点は、直接的な上流または下流の因子またはその中のリン酸化部位の事前知識を必要としないことである。さらに、興味のあるキナーゼの特異的基質が同定されると、同じキナーゼアッセイプロトコールを組換え成分とともに使用して、天然基質に対する比活性を測定し、質量分析と組み合わせた場合の特異的リン酸化部位を同定することができる。このようにして同定された部位は、基質変異体を利用するキナーゼアッセイによってさらに検証することができる。最後に、この方法は、自己リン酸化を検出および測定するためにも使用することができる。

本明細書で提供されるプロトコルは、最適化されたタンパク質精製スキームまたは培養細胞における目的の親和性タグキナーゼを発現するためのトランスフェクション方法のいずれかを前提とする。トランスフェクション、溶解、免疫沈降、およびタンパク質精製のより詳細な解説については、Cold Spring Harbor Protocols ^{6を参照する}ことをお勧めします。アッセイの開発および改変に関する詳細については、「タンパク質リン酸化：選択された方法in Enzymology」を参照してください。