فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب
Summary
تتطور الكينازات البروتينية بشكل كبير الإنزيمات والسقالات التي هي حاسمة لانتشار إشارة بين الخلايا وداخل الخلايا. نقدم بروتوكول لقياس نشاط كيناز من خلال استخدام أدينوسين ثلاثي الفوسفات راديولبلد ([γ- 32 P] أتب)، وهي طريقة موثوق بها للمساعدة في توضيح تنظيم الإشارات الخلوية.
Abstract
البروتينات كيناسس هي قادرة على التحكم في التغيرات الخلوية واسعة النطاق ردا على صفيفات معقدة من المحفزات، وقد وجه الكثير من الجهد للكشف عن تفاصيل مؤكدة لتنظيمها. وتشتمل كيناسيس على شبكات تشوير تكون عيوبها في كثير من الأحيان سمات لأشكال متعددة من السرطان والأمراض ذات الصلة، مما يجعل من منصة فحص قابلة للتلاعب في العوامل التنظيمية المنبع والتحقق من متطلبات رد الفعل الحرجة في البحث عن العلاجات المحسنة. هنا، نحن تصف مقايسة كيناز الأساسية التي يمكن تكييفها بسهولة لتتناسب مع أسئلة تجريبية محددة بما في ذلك ولكن لا تقتصر على اختبار آثار العوامل البيوكيميائية والدوائية، والتلاعب الجيني مثل الطفرة والحذف، وكذلك ظروف زراعة الخلايا والعلاجات للتحقيق آليات تشوير الخلية. هذا الاختبار يستخدم راديولبلد [γ- 32 P] أتب، والذي يسمح للمقارنات الكمية وتصور واضح من النتائج، ويمكن أن يكون وزارة الدفاعإفيد للاستخدام مع إمونوبريسيبيتاتد أو كيناز المؤتلف، ركائز محددة أو مكتوبة، في جميع أنحاء مجموعة واسعة من ظروف التفاعل.
Introduction
بروتينات كيناز هي إنزيمات متطورة حرجة لنقل الإشارات الخلوية إلى ردود مناسبة 1 . ونظرا لأدوارهم في الحفاظ على التوازن والوقاية أو تعزيز حالات المرض 2 ، وأساليب الكيمياء الحيوية لتقييم نشاط كيناز لا تزال أدوات قوية لتحديد معالم الإشارات حقيقية النواة 3 . على الرغم من أن استراتيجيات استخدام الأجسام المضادة الفوسفو محددة كانت مفيدة للغاية من حيث قياس آثار ظروف العلاج المختلفة على حالة الخلية إشارة 4 ، فحص كيناز يسمح لقياس آثار ظروف العلاج المختلفة مباشرة من حيث النشاط الأنزيمي من كيناز من فائدة. في حين أن هناك العديد من الخيارات لفحوصات مماثلة التي لا تستخدم المواد المشعة 5 ، ونحن لا نزال نعتمد على هذه الطريقة لكمية قوية من النتائج. هناكهي اثنين من التطبيقات النموذجية لهذا الفحص، على حد سواء قيمة لأسباب مختلفة: إمونوبريسيبيتاتد (إب) فحص كيناز ( الشكل 1 ) وفحص البروتين كيناز المؤتلف ( الشكل 2 ).
مقايسة كيناز إب مفيدة بشكل كبير لتحديد العوامل القادرة على تفعيل كينازات بروتين معينة وكذلك قياس ظروف العلاج المثبطة. وباختصار، يتم نقل كيناز الممزوجة حاتمة من الفائدة إلى خلايا حقيقية النواة مثقف، يتعرض لمجموعة متنوعة من العلاجات، إمونوبريسيبيتاتد، ومعاير للقدرة على دمج الفوسفات راديولبلد في ركيزة نموذج (على سبيل المثال الميالين البروتين الأساسي (مب)). ويمكن أيضا إجراء فحص كيناز إب دون اللجوء إلى أوفيركسريسيون، إما عن طريق إمونوبريسيانتاتيون من البروتين الذاتية أو أي عدد من تقنيات تحرير الجينوم. لأن العلاجات تدار في الثقافة، وهذا الأسلوب يمكن الكشف عن التحفيز تنتقل من خلال عوامل متعددة المنبعأو مسارات موازية من خلال قراءة في المختبر . ميزة رئيسية واحدة من هذا الأسلوب هو أنه لا يتطلب معرفة مسبقة من العوامل المباشرة المنبع أو المصب أو مواقع الفسفرة فيه. وعلاوة على ذلك، مرة واحدة وقد تم تحديد ركائز محددة لكيناز من الفائدة، ويمكن استخدام نفس بروتوكول فحص كيناز مع مكونات المؤتلف لقياس نشاط معين نحو ركائز الطبيعية وتحديد مواقع فسفرة معينة عندما يقترن تحليل الطيف الكتلي. المواقع التي تم التعرف عليها بهذه الطريقة يمكن التحقق من صحة مزيد من المقايسات مع كيناز استخدام المسوخ الركيزة. وأخيرا، يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة للكشف وقياس أوتوفوسفوريلاتيون.
بروتوكول المقدمة هنا يفترض إما مخطط تنقية البروتين الأمثل أو طريقة ترنسفكأيشن للتعبير عن كيناز تقارب الموسومة من الفائدة في الخلايا المستزرعة. لمعارض أكثر تفصيلا من ترنسفكأيشن، تحلل، إمونوبرسيبيتاتيون، والبروتين بروتين تنقيةأوكولس، نقترح الإشارة إلى البروتوكولات كولد سبرينغ هاربور 6 . لمزيد من المعلومات حول تطوير مقايسة وتعديل، يرجى الرجوع إلى البروتين الفسفرة: طرق مختارة في الإنزيمية 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
كيناسس هي عائلة متنوعة من البروتينات التي تطورت وظائف واسعة في سياقات عديدة، وكانت مقايسات كيناز مفيدة بشكل لا يصدق في دراسة عدة بروتينات التشوير وساهمت بشكل كبير في فهمنا الحالي للاتصالات الخلوية. ومن الجدير بالذكر أن نفس المقايسة الأساسية استخدمت في تمييز كينازي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون جميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر كوب على العمل والمناقشات القيمة، وديون وير للمساعدة الإدارية. وقد دعمت هذه الدراسات من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R37 DK34128 و مؤسسة ولش منحة I1243 إلى مهك
Materials
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
| BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
| BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
| BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
- Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
- Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).
- Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).
- Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).
- . Autoradiography Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011)
- Walker, J. M. . The Protein Protocols Handbook. , (2009).
- Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).
- McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).
- Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).
- Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
- Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).
