Dosage de l'activité des protéines kinase avec ATP radiomarqué

Les protéines kinases sont des enzymes sophistiquées critiques pour la transmission de signaux cellulaires en réponses appropriées ¹ . Étant donné leur rôle dans le maintien de l'homéostasie et la prévention ou la promotion des états pathologiques ² , les méthodes biochimiques pour évaluer l'activité kinase continuent d'être des outils puissants pour délimiter les particularités de la signalisation eucaryote ³ . Bien que les stratégies utilisant des anticorps spécifiques de phospho aient été très informatives en termes de mesure des effets de différentes conditions de traitement sur l'état de signalisation cellulaire ⁴ , un dosage de kinase permet de mesurer directement les effets de différentes conditions de traitement en termes d'activité enzymatique d'une kinase de intérêt. Bien qu'il existe plusieurs options pour des analyses similaires qui n'utilisent pas de matières radioactives ⁵ , nous continuons de compter sur cette méthode pour une quantification robuste des résultats. LàSont deux applications typiques de ce dosage, à la fois précieuses pour différentes raisons: l'essai immunoprécipité (IP) kinase ( figure 1 ) et le dosage recombinant de la protéine kinase ( figure 2 ).

Le test de la kinase IP est extrêmement utile pour identifier les facteurs capables d'activer des protéines kinases spécifiques ainsi que d'évaluer les conditions de traitement inhibiteur. En bref, une kinase marquée par un epitope d'intérêt est transfectée dans des cellules eucaryotes cultivées, soumise à une variété de traitements, immunoprécipitée et testée pour pouvoir incorporer un phosphate radiomarqué dans un substrat modèle ( par exemple, une protéine basique de myéline (MBP)). Le test de la kinase IP peut également être effectué sans recourir à une surexpression, soit par immunoprécipitation de protéines endogènes, soit par n'importe quel nombre de techniques de modification du génome. Parce que les traitements sont administrés en culture, cette méthode peut détecter les stimulations transmises par plusieurs facteurs en amontOu des chemins parallèles par lecture in vitro . L'un des principaux avantages de cette méthode est qu'il ne nécessite pas une connaissance préalable des facteurs directs en amont ou en aval ou des sites de phosphorylation. En outre, une fois que des substrats spécifiques pour une kinase d'intérêt ont été identifiés, le même protocole de dosage de kinase peut être utilisé avec des composants recombinants pour mesurer une activité spécifique vis-à-vis des substrats naturels et identifier des sites de phosphorylation spécifiques lorsqu'ils sont combinés avec une analyse par spectrométrie de masse. Les sites identifiés de cette manière peuvent encore être validés avec des dosages de kinase en utilisant des mutants de substrat. Enfin, cette méthode peut également être utilisée pour détecter et mesurer l'autophosphorylation.

Le protocole fourni ici suppose soit un schéma de purification de protéine optimisé, soit un procédé de transfection pour exprimer une kinase marquée par une affinité intéressant dans des cellules cultivées. Pour des expositions plus détaillées de la transfection, de la lyse, de l'immunoprécipitation et de la purification des protéines protOcols, nous suggérons de se référer aux protocoles Cold Spring Harbor ⁶ . Pour plus d'informations sur le développement et la modification des analyses, veuillez consulter la Phosphorylation des protéines: Méthodes choisies en Enzymologie ⁷ .