Analizzare l'attività della proteina con l'ATP radioattivato
Summary
Le chinasi di proteine sono enzimi e stadi di segnalazione altamente evoluti che sono critici per la trasduzione del segnale inter-e intracellulare. Presentiamo un protocollo per la misurazione dell'attività di chinasi mediante l'uso di trifosfato adenosina radiomarcato ([γ-32P] ATP), un metodo affidabile per aiutare a spiegare la regolazione cellulare di segnalazione.
Abstract
Le proteine chinasi sono in grado di governare cambiamenti cellulari su vasta scala in risposta a complessi array di stimoli, e molto sforzo è stato indirizzato a scoprire dettagli allosterici della loro regolazione. Le cinasi comprendono reti di segnalazione i cui difetti sono spesso segni distintivi di molteplici forme di cancro e malattie correlate, rendendo una piattaforma di analisi suscettibile di manipolare i fattori regolatori a monte e di convalida dei requisiti di reazione critici nella ricerca di terapie migliorate. Qui descriviamo un esame di base di chinasi che può essere facilmente adattato a specifiche questioni sperimentali, tra cui ma non limitandosi a verificare gli effetti degli agenti biochimici e farmacologici, manipolazioni genetiche come la mutazione e la delezione, nonché le condizioni di coltura cellulare e trattamenti a sonda Meccanismi di segnalazione cellulare. Questo saggio utilizza l'ATP [γ- 32 P] radiomarcato, che consente confronti quantitativi e una chiara visualizzazione dei risultati e può essere modSe utilizzati con chinasi immunoprecipitati o ricombinanti, substrati specifici o tipizzati, in una vasta gamma di condizioni di reazione.
Introduction
Le proteine chinasi sono enzimi sofisticati critici per la trasmissione di segnali cellulari in risposte appropriate 1 . Considerati i loro ruoli nel mantenimento dell'omeostasi e nella prevenzione o promozione degli stati di malattia 2 , i metodi biochimici per la valutazione dell'attività di chinasi continuano ad essere strumenti potenti per delineare i particolari della segnalazione eucariotica 3 . Sebbene le strategie che utilizzino anticorpi specifici fosfo-specifici siano stati altamente informativi in termini di misura degli effetti delle diverse condizioni di trattamento sullo stato di segnalazione cellulare 4 , un test di chinasi consente di misurare gli effetti di diverse condizioni di trattamento direttamente in termini di attività enzimatica di una chinasi di interesse. Mentre ci sono diverse opzioni per analisi simili che non utilizzano materiali radioattivi 5 , continuiamo a contare su questo metodo per una robusta quantità di risultati. LàSono due applicazioni tipiche di questo saggio, sia preziose per ragioni diverse: il dosaggio immunoprecipitato (IP) di chinasi ( Figura 1 ) e il test della chinasi della proteina ricombinante ( Figura 2 ).
Il dosaggio di IP chinasi è estremamente utile per identificare fattori capaci di attivare specifiche chinasi proteiche, nonché condizioni di trattamento inibitorie di misura. In breve, una chinasi di interesse etichettata con epitopo viene trasfettata in cellule eucariotiche colte, sottoposte a una varietà di trattamenti, immunoprecipitati e analizzati per la capacità di incorporare fosfato radiomarcato in un substrato di modello ( ad es. Proteina di base di mielina (MBP)). Il test di kinasi IP può anche essere eseguito senza ricorrere all'eccessiva espressione, sia mediante immunoprecipitazione della proteina endogena, o qualsiasi altro numero di tecniche di editing genomico. Poiché i trattamenti vengono somministrati in coltura, questo metodo può rilevare stimoli trasmessi attraverso più fattori a monteO percorsi paralleli mediante lettura in vitro . Un importante vantaggio di questo metodo è che non richiede una conoscenza preliminare di fattori diretti a monte oa valle o siti di fosforilazione in esso. Inoltre, una volta individuati substrati specifici per una chinasi di interesse, è possibile utilizzare lo stesso protocollo di analisi chinasi con componenti ricombinanti per misurare l'attività specifica nei confronti dei substrati naturali e identificare siti specifici di fosforilazione in combinazione con l'analisi di spettrometria di massa. I siti identificati in questo modo possono essere ulteriormente convalidati con i test di chinasi utilizzando mutanti del substrato. Infine, questo metodo può essere usato anche per rilevare e misurare l'autofosforilazione.
Il protocollo fornito qui presuppone uno schema di purificazione della proteina ottimizzata o metodo di trasfezione per esprimere una chinasi di affinità interessata nelle cellule colte. Per esposizioni più dettagliate di trasfezione, lisi, immunoprecipitazione e proteina purificazione protOcols, suggeriamo di riferirsi ai protocolli Cold Spring Harbour 6 . Per ulteriori informazioni riguardanti lo sviluppo e la modifica del test, consultare Proteine Phosphorylation: Metodi selezionati in Enzimologia 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cinasi sono una famiglia diversificata di proteine che hanno evoluto un'ampia funzionalità in numerosi contesti e i dosaggi di chinasi sono stati incredibilmente utili nello studio di diverse proteine di segnalazione e hanno contribuito notevolmente alla nostra attuale comprensione della comunicazione cellulare. In particolare, lo stesso test di base è stato utilizzato per caratterizzare due chinasi disparati nonostante le principali differenze nella struttura e nell'attività. La chinasi WNK1 c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano tutti gli attuali e ex membri del laboratorio di Cobb per lavori e discussioni preziose e Dionne Ware per l'assistenza amministrativa. Questi studi sono stati sostenuti dal National Institutes of Health Grant R37 DK34128 e dalla Fondazione Welch Grant I1243 a MHC
Materials
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
| BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
| BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
| BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
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