Här beskriver vi setup, programvara navigering, och dataanalys för en rumsligt och tidsmässigt exakt metod för att mäta tonic och phasic extracellulära glutamat förändringar in vivo med användning av enzymkopplade mikroelektroduppsättningar (MEA).
Neurotransmittor störning är ofta en nyckelkomponent i sjukdomar i det centrala nervsystemet (CNS), som spelar en roll i patologin underliggande Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, depression och ångest. Traditionellt har mikrodialys varit den vanligaste (hyllade) teknik för att undersöka signalsubstans förändringar som sker i dessa störningar. Men eftersom mikrodialys har förmågan att mäta långsamma 1-20 minuten-ändringar över stora delar av vävnad, har den nackdelen invasivt, potentiellt förstöra inneboende kopplingar i hjärnan och en långsam samplingskapacitet. En relativt nyare teknik, mikroelektroden array (MEA), har många fördelar för att mäta specifika neurotransmittor förändringar inom diskreta hjärnregioner när de uppstår, vilket leder till en rumsligt och tidsmässigt exakt tillvägagångssätt. Dessutom är minimalt invasiv med användning MEA, vilket möjliggör mätning av signalsubstans förändringar in vivo. I vårt laboratorium, vi hahar varit särskilt intresserade av förändringar i neurotransmittorn glutamat, i samband med Alzheimers sjukdom patologi. Som sådan har den här beskrivna metoden använts för att bedöma potentiella hippocampus störningar i glutamat i en transgen musmodell för Alzheimers sjukdom. I korthet använde metod innefattar beläggning av ett multi-site mikroelektrod med ett enzym mycket selektiv för signalsubstansen av intresse och med självrefererande webbplatser för att subtrahera ut bakgrundsbrus och interferenter. Efter plätering och kalibrering, kan MEA konstrueras med en mikropipett och sänks in i hjärnan regionen av intresse med användning av en stereotaktisk anordning. Här, den metod som beskrivs involverar anesthetizing RTG (TauP301L) 4510 möss och med användning av en stereotaxisk anordning för att exakt rikta delregioner (GD, CA1 och CA3) av hippocampus.
Mäta neurotransmittor förändringar i hjärnan är ett viktigt verktyg för neuroforskare som studerar sjukdomar i det centrala nervsystemet (CNS) som ofta kännetecknas av signalsubstans dysreglering. Även om mikrodialys i kombination med högtrycksvätskekromatografi (HPLC / EC) har varit den mest använda metoden för att mäta förändringar i extracellulära signalsubstans nivåerna 1, 2, 3, 4, den spatiala och temporala upplösningen av mikrodialyssonder kan inte vara perfekt för neurotransmittorer , såsom glutamat, som är tätt regleras i det extracellulära utrymmet 5, 6. På grund av de senaste framstegen inom genetik och bildbehandling finns ytterligare metoder som kan användas för att kartlägga glutamat in vivo. Med användning av genetiskt kodade glutamat fluorescerande reportrar (iGluSnFR) end två-photon imaging, forskare har möjlighet att visualisera glutamatfrisättning från neuroner och astrocyter både in vitro och in vivo 7, 8, 9. Noterbart är, ger detta för inspelning från en större synfält och inte störa de inneboende kopplingar i hjärnan. Även om dessa nya optiska teknik möjliggör visualisering av glutamat kinetik och mätning av sensoriska framkallade svar och nervaktivitet, de saknar förmågan att kvantifiera mängden glutamat i det extracellulära utrymmet i diskreta hjärnregioner.
En alternativ metod är den enzymbundna mikroelektrod array (MEA) som selektivt kan mäta extracellulära neurotransmittornivåer, såsom glutamat, genom användningen av en själv refererade schema inspelning. MEA Tekniken har använts för att studera förändringar i extracellulärt glutamat efter traumatisk hjärnskadaskada 10, 11, 12, åldrande 13, 14, stress 15, 16, epilepsi 17, 18, Alzheimers sjukdom 19, 20, och injektion av en viral härma 21 och representerar en förbättring jämfört med de rumsliga och tidsmässiga begränsningar som finns inom mikrodialys. Medan mikrodialys begränsar möjligheten att mäta nära synapsen 22, 23, MEA har en hög rumslig upplösning som möjliggör selektiva åtgärder av extracellulärt glutamat spillover nära synapser 24, 25. Andra, den låga tidsupplösning av mikrodialys (1 – 20 min) begränsar möjligheten att undersökasnabba dynamik glutamatfrisättning och clearance som uppträder i millisekund till andra området 26. Eftersom skillnader i frisättning eller clearance av glutamat kanske inte är uppenbar i åtgärder av toniska, vila glutamatnivåer, kan det vara väsentligt att glutamatfrisättning och clearance mätas direkt. MEA medge sådana åtgärder beroende på deras höga tidsupplösning (2 Hz) och låg detektionsgräns (<1 | iM). Tredje, MEA möjliggöra granskning av subregionala variationer i signalsubstanser inom en särskild hjärnregion, såsom råtta eller mus hippocampus. Exempelvis med användning av MEA kan vi separat rikta dentate gyrus (DG), cornu Ammonis 3 (CA3) och cornu Ammonis 1 (CA1) av hippocampus, vilka är förbundna via en trisynaptic krets 27, för att undersöka subregionala skillnader i extracellulärt glutamat. På grund av storleken av mikrodialyssonder (1 – 4 mm längd) och den skada som orsakas av implantationen 28 </ sup>, 29, subregionala skillnader är svåra att hantera. Dessutom endast de optiska system tillåter stimulering genom externa stimuli, såsom en whisker stimulering eller ljus flimmer, som inte tillåter subregionala stimulering 7. En slutlig fördel med MEA jämfört med andra metoder är förmågan att studera dessa delområden in vivo utan att störa deras yttre och inre anslutningar.
Här beskriver vi hur ett registreringssystem (t.ex. FAST16mkIII) i kombination med MEA, som består av ett keramiskt baserad multisite mikroelektrod, kan differentiellt beläggas på inspelningsplatser för att möjliggöra interfererande medel som skall detekteras och avlägsnas från analyten signalen. Vi visar också dessa matriser kan användas för amperometri baserade studier av in vivo-glutamat reglering inom GD, CA3 och CA1 hippocampusunderregioner av sövda RTG (TauP301L) 4510 möss, en vanligen använd mOuse modell av Alzheimers sjukdom. Dessutom ger vi bekräftelse på känsligheten hos MEA-systemet till de snabba dynamiken i glutamatfrisättning och clearance genom behandling av möss med riluzole, till ett läkemedel visat in vitro minskar glutamatfrisättning och öka glutamatupptaget 30, 31, 32, 33, och demonstrera dessa respektive förändringar i vivo i TauP301L musmodellen.
MEA Tekniken möjliggör mätning av snabb kinetik av neurotransmittorfrisättning och upptag in vitro och in vivo. Därför ger tekniken en mängd olika datautgång inklusive tonic signalsubstans nivåer, framkallad neurotransmittorfrisättning och signalsubstans clearance. Eftersom användningen av MEA är en relativt komplicerad procedur, det finns många faktorer som kan behöva optimeras för framgångsrik användning. Till exempel, under kalibrering, kan man notera att det inte finns några signa…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institute of General Medical Sciences (MNR, U54GM104942), NIA (MNR, R15AG045812), Alzheimers Association (MNR, NIRG-12-242.187), WVU fakulteten Research Senate Grant (MNR) och WVU PSCOR Grant (MNR).
FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
Picospritzer III | Parker | ||
Silver wire | AM systems | 782000 | |
Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
Drill | Dremel | Micro | |
Metricide | Metrex | 102800 | |
Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |