Enzim bazlı biyosensörlerin kullanılması Alzheimer Fare Modellerinde Tonik ve Fazik glutamat Ölçmek için
Summary
Burada, tonik ve enzim-bağlı mikroelektrot dizileri (MEA) kullanılarak in vivo olarak fazik hücre dışı glutamat değişiklikleri ölçmek için bir uzamsal ve zamansal hassas bir yöntem için kurulum, yazılım navigasyon ve veri analizi tarif eder.
Abstract
Nörotransmitter aksama Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, depresyon ve anksiyete altında yatan patolojide rol oynayan, genellikle merkezi sinir sisteminde (MSS) hastalıklarının önemli bir bileşenidir. Geleneksel olarak, mikrodiyaliz bu hastalıklarda meydana nörotransmitter değişiklikleri incelemek için en yaygın (övülen) tekniği olmuştur. Mikrodiyaliz doku büyük alanlar boyunca yavaş 1-20 dakika değişiklikleri ölçmek yeteneğine sahiptir çünkü, bu potansiyel olarak beyin ve yavaş numune alma kabiliyeti olan içsel bağlantıları yok, invaziflik dezavantajına sahiptir. Nispeten yeni bir teknik, mikroelektrot dizi (MEA) meydana olarak bir uzamsal ve zamansal hassas bir yaklaşım için yapım ayrık beyin bölgelerinde spesifik nörotransmitter değişimleri ölçmek için birçok avantajı vardır. Buna ek olarak, ÇÇA kullanılarak in vivo nörotransmiter değişiklikleri ölçme imkanı veren, minimal invaziv. Laboratuvarımızda, biz haAlzheimer hastalığı patolojisi ile ilişkili nörotransmiter, glutamat, değişimlere özel olarak ilgi geçtim. Bu nedenle, burada tarif edilen yöntem, Alzheimer hastalığının bir transgenik fare modelinde glutamat potansiyel hipokampal aksaklıkları değerlendirmek için kullanılmıştır. Kısaca, yöntem, ilgilenilen ve arka plan gürültüsünü ve girişimcileri dışarı çıkarmak için kendinden referanslı siteleri kullanma nörotransmiter için çok seçici bir enzim ile bir çok site mikroelektrot kaplanır; kullanılır. kaplama ve kalibrasyon sonra MEA mikropipet ile tasarlanmış olabilir ve bir stereotaksik aracı kullanılarak ilgili beyin bölgesi içine indirilir. Burada yöntem, RTG (TauP301L) 4510 fareler anestezi ve hassas hipokampusun alt bölgeler (DG, CA1, ve CA3) hedef bir stereotaksik cihaz kullanılarak içerir tarif.
Introduction
beyinde nörotransmitter değişiklikleri ölçme genellikle nörotransmitter düzensizliği ile karakterize edilen merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıklarının araştırılmasında sinirbilimciler için önemli bir araçtır. Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC / EC) ile kombinasyon halinde hücre dışı mikrodiyaliz nörotransmitter seviyeleri 1, 2, değişiklikleri ölçmek için en yaygın olarak kullanılan yöntem olmuştur rağmen, 3, 4, mikrodiyaliz probları uzamsal ve zamansal çözünürlüğü nörotransmiter için ideal olmayabilir , bu şekilde sıkıca hücre dışı alan 5, 6 düzenlenmiştir glutamat gibi. Çünkü genetik ve görüntülemede son gelişmeler, in vivo olarak glutamat eşleştirmek için kullanılabilecek ek yöntem vardır. genetik olarak kodlanmış glutamat floresan haberci kullanılarak (iGluSnFR) bird, çift foton görüntüleme, araştırmacılar, in vitro ve in vivo 7, 8, 9 hem de nöron ve astrositler tarafından glutamat salınmasını görselleştirmek mümkün bulunmaktadır. Özellikle, bu daha geniş bir görüş alanına kayıt için izin verir ve beynin içsel bağlantılarını kesintiye uğratmaz. Bu yeni optik teknikler glutamat kinetik ve duyusal uyarılmış cevaplar ve nöronal aktivitenin ölçümü görselleştirilmesi için imkan vermesine rağmen, farklı beyin bölgelerinde hücre dışı boşlukta glutamat miktarını belirlemek için kabiliyetinden yoksundur.
Alternatif bir yöntem, selektif olarak kendinden başvurulan kayıt düzeni kullanmak suretiyle, glutamat gibi hücre dışı taşıyıcıların seviyelerini ölçebilir, enzime bağlı mikroelektrot dizi (MEA) 'dir. MEA tekniği travmatik beynin aşağıdaki hücre dışı glutamat değişiklikleri incelemek için kullanılmıştıryaşlanma yaralanma 10, 11, 12, 13, 14, stres 15, 16, epilepsi 17, 18, Alzheimer hastalığı 19, 20, ve bir viral mimik 21 enjeksiyonu mikrodiyaliz doğasında uzamsal ve zamansal sınırların üzerinde bir gelişmeyi temsil etmektedir. Mikrodiyaliz sinaps 22, 23 yakınında ölçmek için sınırlayan ise, taraflı çevre hücre dışı glutamat yayılma seçici önlemler yakınındaki 24, 25 sinapsların izin veren yüksek uzamsal çözünürlüğü vardır. İkinci olarak, mikrodiyaliz düşük zamansal çözünürlüğü (1-20 dakika) araştırmak için sınırlarİkinci aralıkta 26 milisaniye meydana gelen glutamat salınımı ve açıklık hızlı dinamikleri. glutamat veya arıtılması farklılıklar glutamat düzeylerini dinlenme tonik ölçümünde de, belirgin olmayabilir, çünkü glutamat salma ve temizlik doğrudan ölçülen edilmesi gerekli olabilir. Taraflı çevre nedeniyle yüksek zamansal çözünürlüğü (2Hz) ve algılama düşük olan bu sınırların (<1 uM) bu tür önlemler için izin verir. Üçüncü olarak, taraflı çevre örneğin sıçan veya fare hipokampta gibi belirli bir beyin bölgesi içinde nörotransmitterlerin alt-varyasyonlar, incelemesine olanak sağlar. Örneğin hücre dışı glutamat alt-farklılıklarını incelemek için, ayrı ayrı dentat girus (DG), bir trisynaptic devresi 27 ile bağlanır, hipokampus, ve cornu ammonis 3 (CA3) ve cornu ammonis 1 (CA1) hedefleyebilir ÇÇA kullanılmıştır. Implantasyon 28 <neden olduğu – (4 mm uzunluğu 1) ve hasar nedeniyle mikrodiyaliz probları büyüklüğü/ sup>, 29 alt-farklar ele almak zordur. Ayrıca, optik sistemler sadece bu alt-stimülasyon 7 izin vermeyen bir bıyık uyarılması veya hafif titreme gibi dış uyarıcılara yoluyla ulaşmayı sağlamaktadır. Diğer yöntemlere göre ÇÇA son bir yararı onların dışsal ve içsel bağlantıları aksatmadan in vivo bu alt bölgeleri incelemek için yeteneğidir.
Burada, bir seramik bazlı çoklu mikroelektrot içeren ÇÇA ile kombinasyon halinde bir kayıt sistemi (örneğin, FAST16mkIII), diferansiyel tayinle ve analit sinyali kaldırılacak maddeleri müdahale sağlamak için kayıt sitelerinde kaplanabilir açıklar. Ayrıca bu diziler amperometri tabanlı DG, CA3 içindeki in vivo glutamat düzenleme çalışmaları ve anestezi uygulanmış RTG CA1 hipokampal alt bölgelerde kullanılabilir göstermektedir (TauP301L) 4510 fareler, yaygın olarak kullanılan bir m,Alzheimer hastalığının ouse modeli. Buna ek olarak, riluzol farelere işlenmesiyle glutamat salınması ve klirens hızlı dinamiklerine MEA duyarlılığın onayı verir, in vitro olarak gösterilen bir ilaç glutamat salınmasını azaltmak ve glutamat alımını 30, 31, 32, 33 arttırılması için ve TauP301L fare modelinde in vivo bu ilgili değişiklikleri gösteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
MEA tekniği, in vitro ve in vivo olarak nörotransmitter salımının ve alımının hızlı kinetik ölçümü sağlar. Bu nedenle, teknik tonik nörotransmitter düzeyleri de dahil olmak üzere veri çıkışı, uyarılmış nörotransmiter salımı ve sinir ileticisi temizlenmesinin bir çok çeşitli üretir. ÇÇA kullanımı nispeten karmaşık bir işlemdir Ancak, başarılı kullanım için optimize edilmesi gerekebilir sayısız faktörler vardır. Örneğin, kalibrasyon sırasında,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
(; U54GM104942 mnr), NIA (mnr; R15AG045812), Alzheimer Derneği (MNR'nin; NIRG-12-242187), SUV Fakültesi Araştırma Senato Grant (mnr) ve SUV PSCOR Grant Bu çalışma, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklendi (MNR).
Materials
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | 782000 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
- Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
- He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
- Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
- Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
- Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), 187-200 (2011).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), 811-820 (2009).
- Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
- Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), 619-627 (2012).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, 77-86 (2011).
- Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), 157-167 (2012).
- Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
- Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders–the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
- Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
- Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
- Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
- Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
- Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), 149-158 (2005).
- Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), 127-135 (2009).
- Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
- Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), 805-814 (2011).
- Frizzo, M. E., Dall’Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
- Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), 171-176 (2008).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).
- Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
- Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer’s disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).
