באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי Enzyme למדוד טוניק ו phasic גלוטמט בעכברי מודל אלצהיימר
Summary
כאן, אנו מתארים את ההתקנה, תוכנת ניווט, וניתוח נתונים עבור שיטה מרחבית מדויקת ובזמן של מדידת טוניק ושינויי גלוטמט תאי פאזית in vivo באמצעות מערכי microelectrode enzyme-linked (MEA).
Abstract
שיבוש עצבי הוא לעתים קרובות מרכיב מרכזי של מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), משחק תפקיד פתולוגיה שבבסיס מחלת אלצהיימר, פרקינסון, דיכאון, וחרדה. באופן מסורתי, microdialysis כבר את הטכניקה הנפוצה ביותר (שיבח) כדי לבחון שינויים הנוירוטרנסמיטר המתרחשים הפרעות אלה. אבל בגלל microdialysis יש את היכולת למדוד איטיים 1-20 שינויים דקים על פני שטחים גדולים של רקמה, יש לו את החסרון של הפולשנות, פוטנציאל להרוס חיבור מהותי בתוך המוח יכולת דגימה איטית. טכניקה חדשה יחסית, מערך microelectrode (MEA), יש יתרונות רבים למדידת שינויים הנוירוטרנסמיטר ספציפיים בתוך אזורים במוח הבדידים כפי שהם מתרחשים, מה שהופך את גישה מדויקת במרחב ובזמן. בנוסף, באמצעות MEAs היא פולשנית, המאפשרת מדידה של שינויים הנוירוטרנסמיטר in vivo. במעבדה שלנו, אנו חהכבר יש מתעניינים במיוחד לשינויים הנוירוטרנסמיטר גלוטמט, הקשורים לפתולוגיה מחלת האלצהיימר. ככזה, השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש כדי להעריך שיבושים בהיפוקמפוס פוטנציאליים גלוטמט במודל של עכברים טרנסגניים של מחלת אלצהיימר. בקצרה, השיטה נהוגה כרוך ציפוי microelectrode רב באתר עם אנזים מאוד סלקטיבית של הנוירוטרנסמיטר עניין בשימוש באתרים המתייחסים לעצמו להפחית את רעשי רקע ואת interferents. לאחר ציפוי וכיול, את MEA ניתן לבנות עם micropipette והוריד לתוך אזור במוח של עניין באמצעות מכשיר stereotaxic. כאן, השיטה המתוארת כרוך בהרדמת RTG (TauP301L) 4510 עכברים באמצעות מכשיר stereotaxic כדי למקד תת אזורים (DG, CA1, ו CA3) של ההיפוקמפוס.
Introduction
מדידת שינויים הנוירוטרנסמיטר במוח הוא כלי חיוני עבור מדעני מוח לומדים מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כי מאופיינות לעתים קרובות הנוירוטרנסמיטר חוסר ויסות. למרות microdialysis בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC / EC) הייתה השיטה הנפוצה ביותר למדוד שינויים ברמות הנוירוטרנסמיטר תאיים 1, 2, 3, 4, ברזולוציה במרחב ובזמן של בדיקות microdialysis לא יכול להיות אידיאלי עבור נוירוטרנסמיטורים , כגון גלוטמט, כי מוסדר בחוזקה בחלל 5 התאים, 6. בגלל ההתקדמות בגנטיקה ודימות, ישנן שיטות נוספות שיכולות לשמש למיפוי גלוטמט in vivo. באמצעות כתבי ניאון גלוטמט מקודדים גנטיים (iGluSnFR) עלד הדמיה שני פוטונים, החוקרים מסוגלים לדמיין שחרור גלוטמט על ידי נוירונים האסטרוציטים הן במבחנה in vivo 7, 8, 9. יש לציין, זה מאפשר הקלטה משדה גדול יותר של נוף ואינו לשבש את החיבור המהותי של המוח. בעוד שיטות האופטיות החדשות אלה מאפשרות להדמיה של קינטיקה גלוטמט ומדידה של תגובות חושיות ומתחזקות פעילות עצבית, הם חסרים את היכולת לכמת את כמות הגלוטמט שטח תאי מוח באזורים דיסקרטיים.
שיטה חלופית היא מערך microelectrode enzyme-linked (MEA) שיכול למדוד באופן סלקטיבי רמות הנוירוטרנסמיטר תאיות, כגון גלוטמט, באמצעות ערכת הקלטה בהפניה עצמית. טכניקת MEA נוצלה בעבר ללמוד שינויי גלוטמט התאים הבאים מוחי טראומטיפציעה 10, 11, 12, הזדקנות 13, 14, מתח 15, 16, אפילפסיה 17, 18, 19 מחלת אלצהיימר, 20, ו הזרקה של 21 ויראלי לחקות ומייצג שיפור לעומת מגבלות המרחב והזמן הגלום microdialysis. בעוד microdialysis מגביל את היכולת למדוד בקרבת הסינפסות 22, 23, יש MEAs רזולוציה מרחבית גבוהה המאפשרת אמצעים סלקטיבית של זליגת גלוטמט תאי ליד הסינפסות 24, 25. שנית, ההחלטה הזמנית הנמוכה של microdialysis (1 – דק 20) מגבילה את היכולת לחקור אתדינמיקה מהירה של שחרור גלוטמט וסילוק המתרחשת האלפית השני כדי הטווח שני 26. בגלל הבדלי השחרור או השחרור של גלוטמט לא יכולים להיות ברורים במדדים של טוניק, נחים רמות גלוטמט, זה עשוי להיות חיוני כי שחרור גלוטמט וסילוק להימדד ישירות. MEAs לאפשר אמצעים כאלה עקב הרזולוציה הגבוהה הזמנית שלהם (2 הרץ) ומגבלות נמוכות של זיהוי (<1 מיקרומטר). שלישית, MEAs מאפשרים לבחון וריאציות תת-ב נוירוטרנסמיטורים בתוך אזור במוח מסוים, כגון בהיפוקמפוס חולדה או עכבר. לדוגמא, באמצעות MEAs אנחנו בנפרד יכולים למקד gyrus המשוננת (DG), קורנו ammonis 3 (CA3) ו קורנו ammonis 1 (CA1) של ההיפוקמפוס, אשר מחוברים באמצעות במעגל trisynaptic 27, לבחון הבדלים תת-ב גלוטמט התאי. בשל גודלו של בדיקות microdialysis (1 – 4 מ"מ אורך) ואת הנזק שנגרם על ידי השתלת 28 </ sup>, 29, הבדלים תת-קשים להתמודד. יתר על כן, המערכות האופטיות רק מאפשרות גירוי באמצעות גירויים חיצוניים, כגון גירוי שפם או הבהוב אור, אשר אינו מאפשר תת-גירוי 7. יתרון סופי של MEAs פני שיטות אחרות הוא היכולת ללמוד אזורי משנה אלה in vivo מבלי לשבש הקשרים החיצוניים ו פנימיים שלהם.
כאן, אנו מתארים כיצד מערכת הקלטה (למשל, FAST16mkIII) בשילוב עם MEAs, מורכב microelectrode ריבוי אתרי קרמיקה מבוססת, יכולה להיות מצופית באופן דיפרנציאלי על אתרי הקלטה כדי לאפשר להתערב סוכנים כדי להיות גילוי והסרה מן האות אנליטי. אנחנו גם להדגים ניתן להשתמש במערכים אלה ללימודי מבוססי amperometry של רגולציה גלוטמט in vivo בתוך DG, CA3, ואת אזורי המשנה בהיפוקמפוס CA1 של RTG הרדים (TauP301L) 4510 עכברים, מ נפוץמודל יד הבית של מחלת אלצהיימר. בנוסף, אנו מספקים אישור של רגישות מערכת MEA לדינמיקה המהירה של שחרור גלוטמט וסילוק ידי טיפול בעכברים עם riluzole, תרופה לראות במבחנה כדי להקטין שחרור גלוטמט ולהגדיל ספיגת גלוטמט 30, 31, 32, 33, והוכחת השינויים האלה בהתאמה in vivo במודל עכבר TauP301L.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקת MEA מאפשרת מדידה של קינטיקה המהירה של שחרור הנוירוטרנסמיטר ספיג במבחנה ובחי. לפיכך, הטכנולוגיה מייצרת מגוון רחב של פלט נתונים כולל רמות הנוירוטרנסמיטר טוניק, שחרור הנוירוטרנסמיטר עורר, וסילוק הנוירוטרנסמיטר. עם זאת, בגלל השימוש MEAs היא הליך מורכב יחסי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), איגוד האלצהיימר (MNR; NIRG-12-242,187), גרנט הסנאט סגל מחקר WVU (MNR), ו WVU PSCOR גרנט (MNR).
Materials
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | 782000 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
- Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
- He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
- Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
- Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
- Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), 187-200 (2011).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), 811-820 (2009).
- Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
- Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), 619-627 (2012).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, 77-86 (2011).
- Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), 157-167 (2012).
- Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
- Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders–the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
- Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
- Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
- Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
- Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
- Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), 149-158 (2005).
- Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), 127-135 (2009).
- Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
- Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), 805-814 (2011).
- Frizzo, M. E., Dall’Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
- Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), 171-176 (2008).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).
- Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
- Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer’s disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).
