باستخدام أجهزة الاستشعار مقرها انزيم لقياس تونيك وطوري الغلوتامات في نماذج الماوس الزهايمر
Summary
هنا، نحن تصف الإعداد والملاحة البرمجيات، وتحليل البيانات لطريقة مكانيا وزمانيا دقيقة لقياس منشط وطوري التغييرات الغلوتامات خارج الخلية في الجسم الحي باستخدام صفائف مسرى مكروي انزيم مرتبط (MEA).
Abstract
اضطراب النواقل العصبية وغالبا ما يكون عنصرا أساسيا في أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS)، ولعب دورا في علم الأمراض الكامنة وراء مرض الزهايمر ومرض باركنسون، والاكتئاب، والقلق. تقليديا، كانت microdialysis الأكثر شيوعا (أشاد) تقنية لدراسة التغيرات العصبي التي تحدث في هذه الاضطرابات. ولكن بسبب microdialysis لديه القدرة على قياس التغيرات بطيئة 1-20 دقيقة عبر مناطق واسعة من الأنسجة، فمن لديه عيب الغازية، يحتمل تدمير اتصالات الجوهرية في الدماغ وقدرة أخذ العينات بطيئة. وهناك تقنية جديدة نسبيا، ومجموعة مسرى مكروي (MEA)، له مزايا عديدة لقياس التغيرات العصبي محددة في مناطق الدماغ منفصلة وقوعها، مما يجعل لنهج دقيق مكانيا وزمانيا. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف هو الغازية الحد الأدنى، مما يسمح لقياس التغيرات العصبي في الجسم الحي. في المختبر لدينا، ونحن هالقد كان مهتما على وجه التحديد في التغيرات في الناقل العصبي، الغلوتامات، المتعلقة علم الأمراض مرض الزهايمر. على هذا النحو، وقد استخدم الطريقة الموصوفة هنا لتقييم اضطرابات الحصين المحتملة في الغلوتامات في نموذج الفأر وراثيا لمرض الزهايمر. لفترة وجيزة، استخدام أسلوب ينطوي على طلاء ومسرى مكروي مواقع متعددة مع انزيم انتقائية للغاية بالنسبة للناقل عصبي من الاهتمام وباستخدام مواقع المرجعية الذاتية لطرح الضوضاء الخلفية وinterferents. بعد الطلاء والمعايرة، وMEA يمكن بناؤها مع micropipette وإنزالها في منطقة الدماغ ذات الاهتمام باستخدام جهاز التجسيمي. هنا، وصف الطريقة تنطوي التخدير RTG (TauP301L) 4510 الفئران وباستخدام جهاز التجسيمي لاستهداف بدقة المناطق الفرعية (DG، CA1، وCA3) من الحصين.
Introduction
قياس التغيرات العصبي في الدماغ هو أداة أساسية لعلماء الأعصاب دراسة أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) التي غالبا ما تتميز التقلبات العصبي. على الرغم من microdialysis في تركيبة مع ارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC / EC) كانت الطريقة الأكثر استخداما على نطاق واسع لقياس التغيرات في مستويات النواقل العصبية خارج الخلية 1، 2، 3، 4، القرار المكاني والزماني للتحقيقات microdialysis قد لا تكون مثالية لالناقلات العصبية مثل الجلوتامات، التي تنظم بإحكام في الفضاء خارج الخلية 5 و 6. بسبب التطورات الحديثة في مجال علم الوراثة والتصوير، وهناك طرق إضافية التي يمكن استخدامها لرسم خريطة الغلوتامات في الجسم الحي. باستخدام المشفرة وراثيا للصحفيين الغلوتامات الفلورسنت (iGluSnFR) لد ثنائي الفوتون التصوير والباحثين قادرين على تصور الافراج عن الغلوتامات من الخلايا العصبية والخلايا النجمية على حد سواء في المختبر والمجراة 7 و 8 و 9. والجدير بالذكر أن هذا يسمح لتسجيل من أكبر مجال الرؤية ولا يعطل الاتصالات الجوهرية من الدماغ. في حين أن هذه التقنيات البصرية الجديدة تسمح لرؤية حركية الغلوتامات وقياس ردود أثار الحسية ونشاط الخلايا العصبية، فإنها تفتقر إلى القدرة على تحديد كمية الصوديوم في الفضاء خارج الخلية في مناطق الدماغ منفصلة.
طريقة بديلة هو انزيم مرتبط مسرى مكروي مجموعة (MEA) التي يمكن قياس مستويات الناقل العصبي بشكل انتقائي خارج الخلية، مثل الجلوتامات، من خلال استخدام نظام تسجيل المرجعية الذاتية. وقد استخدمت هذه التقنية MEA لدراسة التعديلات في الغلوتامات خارج الخلية التالية الدماغ الصدمةإصابة 10، 11، 12، الشيخوخة 13 و 14، والإجهاد 15 و 16 و الصرع 17 و 18 و مرض الزهايمر 19 و 20، وحقن تقليد 21 الفيروسي ويمثل تحسنا عن القيود المكانية والزمانية الكامنة في microdialysis. في حين microdialysis يحد من القدرة على قياس قرب المشبك 22 و 23 و الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لديها القرار المكانية العالية التي تسمح للتدابير انتقائية من امتداد الغلوتامات خارج الخلية نقاط الاشتباك العصبي قرب 24 و 25. ثانيا، القرار الزماني انخفاض microdialysis (1-20 دقيقة) يحد من القدرة على التحقيق فيديناميكية سريعة للإفراج الغلوتامات والتخليص التي تحدث في ميلي ثانية واحدة إلى مجموعة الثانية 26. بسبب الاختلافات في الإفراج عنهم أو إزالة الغلوتامات قد لا يكون واضحا في تدابير منشط، ويستريح مستويات الغلوتامات، قد يكون من الضروري أن الإفراج عن الغلوتامات وإزالة قياسها مباشرة. الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تسمح لمثل هذه التدابير بسبب قرارهم عالية الزماني (2 هرتز) وحدود منخفضة من كشف (<1 ميكرومتر). ثالثا، الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تسمح للفحص من الاختلافات دون الإقليمية في الناقلات العصبية في منطقة الدماغ معينة، مثل الفئران أو الماوس الحصين. على سبيل المثال، وذلك باستخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف يمكننا استهداف حدة التلفيف المسنن (DG)، قرن آمون 3 (CA3) وقرن آمون 1 (CA1) من الحصين، والتي ترتبط عبر دائرة trisynaptic 27، لدراسة الاختلافات دون الإقليمية في الغلوتامات خارج الخلية. ونظرا لحجم تحقيقات microdialysis (1 – طول 4 ملم) والأضرار الناجمة عن زرع 28 </ سوب>، 29، والاختلافات دون الإقليمية يصعب معالجتها. وعلاوة على ذلك، فإن النظم البصرية تسمح فقط التحفيز من خلال مؤثرات الخارجية، مثل التحفيز الطولي أو وميض ضوء، والتي لا تسمح التحفيز دون 7. هناك فائدة النهائي من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف على أساليب أخرى هي القدرة على دراسة هذه المناطق الفرعية في الجسم الحي دون تعطيل صلاتهم خارجي والجوهرية.
هنا، نحن تصف كيف يمكن لنظام التسجيل (على سبيل المثال، FAST16mkIII) بالاشتراك مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، ويتألف من مسرى مكروي متعددة المواقع القائمة على السيراميك، ويمكن أن تكون مغلفة بشكل مختلف على مواقع تسجيل للسماح للتدخل وكلاء ليتم الكشف عن وإزالتها من إشارة تحليلها. كما تبين لنا هذه المصفوفات يمكن استخدامها للدراسات القائم على أمبيرية في الجسم الحي تنظيم الغلوتامات داخل DG، CA3، والمناطق الفرعية CA1 الحصين للتخدير RTG (TauP301L) 4510 الفئران، وهي تستخدم عادة منموذج [أوس] من مرض الزهايمر. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم تأكيدا على حساسية نظام MEA لديناميات بسرعة الإفراج الغلوتامات وإزالتها عن طريق التعامل مع الفئران مع ريلوزول، وهو دواء هو مبين في المختبر لتقليل إطلاق الغلوتامات وزيادة الغلوتامات امتصاص 30، 31، 32، 33، ومما يدل على هذه التغييرات منها في الجسم الحي في نموذج الفأر TauP301L.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية MEA تسمح لقياس حركية سريعة للإفراج العصبي وامتصاص في المختبر والمجراة. وبالتالي، فإن التكنولوجيا وتنتج مجموعة واسعة من إخراج البيانات بما في ذلك مستويات الناقل العصبي منشط، أثار الافراج عن العصبي، وإزالة العصبي. ومع ذلك، لأن استخدام الاتفاقات البيئي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (MNR، U54GM104942)، NIA (MNR، R15AG045812)، جمعية الزهايمر (MNR، NIRG-12-242187)، وفو كلية البحوث في مجلس الشيوخ غرانت (MNR)، ووفو PSCOR غرانت (MNR).
Materials
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | 782000 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
References
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
- Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
- He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
- Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
- Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
- Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), 187-200 (2011).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), 811-820 (2009).
- Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
- Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), 619-627 (2012).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, 77-86 (2011).
- Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), 157-167 (2012).
- Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
- Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders–the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
- Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
- Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
- Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
- Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
- Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), 149-158 (2005).
- Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), 127-135 (2009).
- Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
- Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), 805-814 (2011).
- Frizzo, M. E., Dall’Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
- Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), 171-176 (2008).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).
- Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
- Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer’s disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).
