Summary

En utilisant biocapteurs à base d'enzymes pour mesurer Tonic et Phasic Glutamate dans les modèles murins d'Alzheimer

Published: May 03, 2017
doi:

Summary

Ici, nous décrivons la configuration, la navigation logicielle, et l' analyse de données pour une méthode spatiale et temporelle précise de la mesure tonique et les changements de glutamate extracellulaire phasiques in vivo en utilisant des réseaux de microélectrodes enzyme-linked (MEA).

Abstract

perturbation neurotransmetteur est souvent un élément clé des maladies du système nerveux central (SNC), jouant un rôle dans la pathologie sous-jacente de la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la dépression et l'anxiété. Traditionnellement, microdialyse a été le plus commun (louangé) technique pour examiner les changements de neurotransmetteurs qui se produisent dans ces troubles. Mais parce que microdialyse a la capacité de mesurer les changements lents 1-20 minute dans de vastes zones de tissu, il présente l'inconvénient d'invasivité, risque de détruire les connexions intrinsèques dans le cerveau et une capacité d'échantillonnage lente. Une technique relativement récente, la matrice de microélectrodes (MEA), présente de nombreux avantages pour la mesure des changements de neurotransmetteurs spécifiques au sein des régions discrètes du cerveau comme ils se produisent, ce qui rend une approche spatiale et temporelle précise. En outre, en utilisant les AME est peu invasive, permettant la mesure des modifications de neurotransmetteurs in vivo. Dans notre laboratoire, nous have été particulièrement intéressés par des changements dans le neurotransmetteur, le glutamate, lié à la pathologie de la maladie d'Alzheimer. En tant que tel, la méthode décrite ici a été utilisé pour évaluer les perturbations potentielles hippocampiques en glutamate dans un modèle de souris transgénique de la maladie d'Alzheimer. En bref, le procédé utilisé consiste à enduire une microélectrode multi-site avec une enzyme très sélective pour le neurotransmetteur d'intérêt et l'utilisation de sites d'auto-référencement pour soustraire le bruit de fond et les interférents. Après étalement et d'étalonnage, on peut construire la MEA avec une micropipette et abaissé dans la région du cerveau d'intérêt à l'aide d'un appareil stéréotaxique. Ici, le procédé décrit consiste à anesthésier RTG (TauP301L) 4510 souris et en utilisant un appareil stéréotaxique afin de cibler avec précision les sous-régions (DG, CA1 et CA3) de l'hippocampe.

Introduction

La mesure des modifications de neurotransmetteurs dans le cerveau est un outil essentiel pour l'étude des maladies neuroscientifiques du système nerveux central (SNC) qui sont souvent caractérisées par la dérégulation des neurotransmetteurs. Bien que microdialyse en combinaison avec une Chromatographie liquide haute pression (HPLC / CE) est la méthode la plus largement utilisée pour mesurer les changements dans les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaires 1, 2, 3, 4, la résolution spatiale et temporelle des sondes de microdialyse peuvent ne pas être idéal pour les neurotransmetteurs , tel que le glutamate, qui sont étroitement régulée dans l'espace extracellulaire 5, 6. En raison des progrès récents de la génétique et de l' imagerie, il existe d' autres méthodes qui peuvent être utilisées pour cartographier le glutamate in vivo. Utilisation reporters fluorescents glutamate génétiquement codés (iGluSnFR) und ' imagerie à deux photons, les chercheurs sont capables de visualiser la libération de glutamate par les neurones et les astrocytes in vitro et in vivo 7, 8, 9. En particulier, cela permet d'enregistrer à partir d'un champ de vision plus large et ne perturbe pas les connexions intrinsèques du cerveau. Bien que ces nouvelles techniques optiques permettent la visualisation de la cinétique du glutamate et mesure des réponses sensorielles et de l'activité neuronale évoqués, ils ne sont pas capables de quantifier la quantité de glutamate dans l'espace extracellulaire dans les régions discrètes du cerveau.

Une autre méthode est la matrice de microélectrodes (MEA) lié à une enzyme qui permet de mesurer de manière sélective les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaire, tels que le glutamate, par l'utilisation d'un système d'enregistrement auto-référencée. La technique de MEA a été utilisée pour étudier les modifications dans le glutamate extracellulaire après cérébrales traumatiquesblessure 10, 11, 12, vieillissement de 13, 14, le stress 15, 16, l' épilepsie 17, 18, la maladie d'Alzheimer 19, 20, et l' injection d'un synoptique viral 21 et représente une amélioration par rapport aux limites spatiales et temporelles inhérentes à la microdialyse. Alors que microdialyse limite la capacité à mesurer près de la synapse 22, 23, AME ont une haute résolution spatiale qui permet des mesures sélectives de glutamate extracellulaire empiétement synapses près de 24, 25. En second lieu, la faible résolution temporelle de microdialyse (1 – 20 min) limite la possibilité d'étudier ladynamique rapide de la libération et la clairance du glutamate qui se produisent dans la milliseconde à la deuxième plage 26. En raison des différences dans la libération ou la clairance du glutamate peuvent ne pas être évident dans les mesures de tonique, de repos taux de glutamate, il peut être essentiel que mesurer directement la libération et la clairance du glutamate. AME permettent de telles mesures en raison de leur haute résolution temporelle (2 Hz) et faibles limites de détection (<1 um). En troisième lieu, les AEM permettent l'examen des variations sous-régionales dans les neurotransmetteurs dans une région particulière du cerveau, telles que l'hippocampe de rat ou de la souris. Par exemple, en utilisant AME on peut cibler séparément le gyrus denté (DG), corne d' Ammon 3 (CA3) et corne d' Ammon 1 (CA1) de l'hippocampe, qui sont reliés par l' intermédiaire d' un circuit trisynaptic 27, pour examiner les différences sous – régionaux de glutamate extracellulaire. En raison de la taille des sondes de microdialyse (1 – longueur de 4 mm) et les dommages causés par l' implantation 28 </ sup>, 29, les différences sous – régionales sont difficiles à traiter. En outre, les systèmes optiques ne permettent la stimulation par des stimuli externes, comme une stimulation ou quartiles le scintillement de lumière, ce qui ne permet pas la stimulation sous – régionale 7. Un dernier avantage des AME par rapport aux autres méthodes est la possibilité d'étudier ces sous – régions in vivo sans perturber leurs relations extrinsèques et intrinsèques.

Ici, nous décrivons comment un système d'enregistrement (par exemple, FAST16mkIII) en combinaison avec les AEM, consistant en une microélectrode multisite à base de céramique, peut être revêtue de façon différentielle sur les sites d'enregistrement pour permettre à des agents interférant être détectés et supprimés à partir du signal d'analyte. Nous démontrons également ces tableaux peuvent être utilisés pour des études à base ampérométrie-de régulation du glutamate in vivo au sein de la DG, CA3 et sous – régions hippocampiques CA1 de ELO anesthésié (TauP301L) 4510 souris, un couramment utilisé mmodèle Ouse de la maladie d'Alzheimer. De plus, nous confirmons que la sensibilité du système de MEA à la dynamique rapide de la libération du glutamate et la clairance en traitant les souris avec riluzole, un médicament montré in vitro pour diminuer la libération du glutamate et d' augmenter l' absorption du glutamate 30, 31, 32, 33, et de démontrer ces changements respectifs in vivo dans le modèle de souris TauP301L.

Protocol

1. Le revêtement de la matrice de microélectrodes avec des enzymes ou couche matricielle Préparation de la solution de matrice protéique Peser 10 mg d'albumine de sérum bovin (BSA) et le transférer à la 1,5 mL tube de microcentrifugation. Ajouter 985 ul d'eau DI au microtube contenant de la BSA. Mélanger la solution par agitation manuelle (re-pipetage avec une pipette de 1000 ul ~ 3 fois, jusqu'à ce que la BSA est dissous). REMAR…

Representative Results

Bien que cette technologie peut être utilisée pour mesurer des modifications dans glutamatergique de signalisation dans de nombreux types de modèles animaux, tels que des lésions cérébrales traumatiques, le vieillissement, le stress et l'épilepsie, ici nous montrons comment la technologie MEA peut être utilisé pour examiner les modifications glutamatergiques dans le modèle de souris transgénique de tauopathie humain 19, …

Discussion

La technique de MEA permet de mesurer la cinétique rapide de la libération et l' absorption neurotransmetteur in vitro et in vivo. Par conséquent, la technologie produit une grande variété de la production de données, y compris les niveaux de neurotransmetteurs tonique, la libération des neurotransmetteurs évoqué, et la clairance des neurotransmetteurs. Cependant, parce que l'utilisation des AME est une procédure relativement complexe, il existe de nombreux facteurs qui peuvent avoir …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l'Institut national des sciences médicales générales (MRN, U54GM104942), NIA (MRN, R15AG045812), l'Association Alzheimer (MRN, NIRG-12-242187), WVU Faculté Sénat Subvention de recherche (MRN), et WVU PSCOR Grant (MRN).

Materials

FAST-16mkIII-8 channel Quanteon 16mkIII
Microelectrode arrays CenMet W4 or 8-TRK
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A-3059 10 g (expires after 1 month)
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G-6257 100 mL (expires after 6 months)
Glutamate Oxidase US Biological or Sigma Aldrich G4001-01 or 100646 50 UI (expires after 6 months)
Hamilton Syringes Hamilton #701 2 syringes
Methanol BDH UN1230 4 L
m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) ACROS Organics 1330560250 25 g
Reference Electrodes (RE-5B) BAS MF-2079 3 electrodes
Magnetic stir plate Cole-parmer EW-04804-01 Can purchase from different supplier
Glutamate Sigma-Aldrich G-1626 100 g
Ascorbic Acid TCI 50-81-7 500 g
Dopamine Hydrochloride Alfa Aesar 62-31-7 5 g
Perchloric acid VWR UN2920 500 mL
Postassium chloride VWR 7447-40-7 1 kg
Sodium chloride VWR 7647-40-7 1 kg
Calcium Chloride MP 153502 100 g
Sodium Hydroxide BDH 1310732 500 g
Glass pressure ejection pipettes CenMet
Sticky wax Kerrlab 625 Can purchase from different supplier
Microsyringe World Precision Instruments MF28G-5
Modeling clay WalMart Can purchase from different supplier
Picospritzer III Parker
Silver wire AM systems 782000
Hydrochloric acid BDH 7647010 2.5 L
Platinum wire AM Systems 778000
Solder gun Lowes or Home Depot Can purchase from different supplier
Multimeter WalMart Can purchase from different supplier
PhysioSuite Kent Scientific Can purchase from different supplier
SomnoSuite Kent Scientific Can purchase from different supplier
Stereotaxic device Stoelting Can purchase from different supplier
Digital Lab Standard Stoelting Can purchase from different supplier
Meiji EMZ microscope Meiji EMZ-5
Drill Dremel Micro
Metricide Metrex 102800
Scalpel VWR Can purchase from different supplier
Surgery scissors VWR Can purchase from different supplier
Sterile cotton swabs Puritan 25806 Can purchase from different supplier
Eye ointment Puralube Vet Ointment Obtain from the vet
Iodine swabs VWR S48050 Can purchase from different supplier
Alcohol swabs Local drug store Can purchase from different supplier
Sterile surgery drape Dynarex 4410 Can purchase from different supplier
Sterile saline Teknova S5815 Can make own soltuion using filters
Hydrogen Peroxide (3%) Local drug store Can purchase from different supplier
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References

  1. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  2. Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
  3. Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
  4. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
  5. Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
  6. He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
  7. Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
  8. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  9. Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
  10. Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
  11. Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), 187-200 (2011).
  12. Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
  13. Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), 811-820 (2009).
  14. Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
  15. Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), 619-627 (2012).
  16. Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
  17. Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, 77-86 (2011).
  18. Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), 157-167 (2012).
  19. Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
  20. Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
  21. Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
  22. Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders–the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
  23. Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
  24. Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
  25. Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
  26. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
  27. Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
  28. Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), 149-158 (2005).
  29. Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), 127-135 (2009).
  30. Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
  31. Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), 805-814 (2011).
  32. Frizzo, M. E., Dall’Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
  33. Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), 171-176 (2008).
  34. Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).
  35. Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
  36. Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
  37. Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer’s disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
  38. Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).

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Hunsberger, H. C., Setti, S. E., Heslin, R. T., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer’s Mouse Models. J. Vis. Exp. (123), e55418, doi:10.3791/55418 (2017).

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