96 oyuklu bir plaka içerisinde hücre gücü / yara iyileşme gerçekleştirmek için bir cihaz
Summary
Burada, bir 96-yuvalı hücre kültürü plakasının bir yarı-yüksek verimli hücre göçü deneyi gerçekleştirmek için bir protokol mevcut. Bu protokol, bir hücre tek tabaka üzerinde tutarlı çizik yaraları oluşturmak için hızlı, basit ve ekonomik bir yöntemdir.
Abstract
Hücre göçü / tahlil yaralama hücre göçü ve anjiyogenez ve tümör metastazı gibi diğer biyolojik süreçleri incelemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu tahlilde, hücreler konfluent tek tabaka oluşturmak için büyütülür ve mekanik bir yara bir cihaz ile çizilerek oluşturulur. Sonra soyulmuş alanına doğru hücrelerinin göç hızı görüntüleme ile izlenebilir. Bizim 8 kanallı mekanik wounder hücre göçü deneyi ile ilişkili sorunların çoğunu çözmek için tasarlanmıştır. Birincisi, bizim wounder kolayca otoklav ile veya ortak dezenfektanlar ile sterilize edilebilir. İkinci olarak, tek tek ayarlanabilen pimleri daha keskin ve tekrarlanabilir yaralar oluşturulabilir, böylece hücre kültür plakası ile temas etmesi. Üçüncü olarak, wounder her iki tarafında kılavuz çubukları her bir tutarlı yaralama pozisyonunu garantiler. ayrıca wounder daha iyi yol tutuşu sağlayabilir yanı sıra çapraz contaminat en aza indirmek için yaralama için tek kullanımlık plastik pipet uçlarının kullanılmasıiyon. Sonuç olarak, hücre wounder standart 96 oyuklu bir kültür plakası kullanarak hücre göçü deneyi gerçekleştirmek için bir kullanıcı dostu ve yeniden üretilebilir bir cihazla araştırmacılar sağlayabilir.
Introduction
Hücre göçü gibi embriyojenez, nöron, anjiyogenez, yara iyileşmesi, mukozal tamiri, normal gelişim ve hastalık durumuna 1 altında epitelyal-mezenkimal-geçişler gibi hücresel süreçleri de önemli bir rol oynar. Bu sinyal molekül etkileşimleri, hücre kutuplaşma, hücre iskeleti yeniden, matris yeniden membran çıkıntı ve dinamik hücre-hücre yapışması modülasyonu 2 olmak üzere çok sayıda içi ve hücresel olayların koordinasyonunu içeren karmaşık bir süreçtir. hücre göçü inceleyerek, hücre hareketi ve bununla ilgili biyokimyasal yollar yol açan kimyasal madde veya biyomoleküllerin keşif ve doğrulama tespit edilebilir. Bu temel süreç böyle hastalık tedavisi ve ilaç hedefleme gibi çeşitli uygulamalar için bir vekil olarak yararlı bir şekilde kullanılabilir.
Yaralama deney hücre göçü deneyleri 3 biridir. Burada, birhücrelerin tek tek örnek, kısmen hücre alanı kapsayacak şekilde göç bir soyulmuş alanı üretmek için mekanik araçlar ile kaldırılır. Belirli bir zaman noktasında geri kazanım yüzdesi izlenecektir. Örneklerin çok sayıda tutarken, bu tür örneklerin içinde deneysel maliyet ve çapraz kontaminasyon gibi konular sorunlu olabilir. Pek çok ticari araçlar ve deneyler, hücre göçü 4, 5, 6, çalışmak için uygun olmakla birlikte, bunların çok pahalı ve karmaşık ekipmanlar gerekmektedir ve geliştirmeler de ihtiyaç vardır. Bu nedenlerden dolayı, 8-kanallı mekanik hücre wounder (Şekil 1) olarak geliştirilmiştir.
Bizim 8-kanal mekanik hücre wounder yukarıda belirtilen sorunların çözümünde birçok benzersiz özelliklere yer vermiş. Bu 96 gözlü kültür plakası formatında tahlilleri yaralama / hücre göçü gerçekleştirmek için esneklik sağlar. ayarlanabilir guiding bar tasarımı karalama alanı de her merkezi konumda olmasını sağlar. wounder kültür plakalarının çeşitli markalar için geçerlidir, böylece aynı zamanda, yönlendirme çubuklarının yüksekliğinin ayarlanabilir. Son olarak, ayarlanabilir yaralama pimi tasarımı aynı anda ve tekrarlanabilir yaralama 7, 8 ulaşmak için kültür plaka yüzeyi ile pipet uçları eşit teması sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bizim hücre wounder geleneksel hücre göçü deneyleri sorunlarını çözmede birçok benzersiz özelliklere sahiptir. 8-kanallı mekanik hücre wounder otoklav ile sterilize edilebilir, uzun ömürlü, yüksek dereceli paslanmaz çelik (çelik 304) yapılmıştır. piyasada bulunan 96 oyuklu kültür plakaları neredeyse tüm ticari markalar için ayarlanabilir kılavuz çubuğunun bu mekanik hücre wounder kullanılabilir. Ayarlanabilir kılavuz çubuğunun tasarımı da kazıma alanı her bir merkezinde olmasını…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bu wounder prototipini yapımında Sayın Tam Po Leung, Bay Wong Chi Kin ve teknik becerileri Fen Fakültesi Atölyesi teknik personel, Hong Kong Baptist Üniversitesi ve danışmanlık teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A., Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980 (2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
