Устройства для осуществления миграции клеток / заживлении ран в 96-луночный планшет
Summary
Здесь мы приводим протокол для выполнения полупроницаемую с высокой пропускной способностью анализа миграции клеток на 96-луночный культуральный планшет. Этот протокол является быстрый, простой и экономичный способ создать логичную скретч раны на клетку монослоя.
Abstract
Миграции клеток / ранив анализа является широко используемым методом для изучения миграции клеток и другие биологические процессы, такие как ангиогенез и метастазирование опухоли. В этом анализе клетки выращивают с образованием сливающийся монослой и механический рана создается царапанием с устройством. Тогда скорость миграции клеток по отношению к обнаженную область можно контролировать с помощью визуализации. Наш 8-канальный механический wounder предназначен для решения большинства проблем, связанных с миграцией клеток анализа. Во-первых, наша wounder можно легко стерилизовать автоклавированием или с общими дезинфицирующими средствами. Во-вторых, отдельные регулируемые штифты позволяют даже контактировать с клеточной культуральной пластины таким образом, что могут быть созданы острые и воспроизводимые раны. В-третьих, направляющие стержни с обеих сторон wounder обеспечить последовательную позицию ранив в каждую лунку. Использование одноразовых наконечников пластиковой пипетки для ранении может дополнительно обеспечивать лучшее обработку wounder, а также свести к минимуму перекрестные contaminatиона. В заключение, наша ячейка wounder может предоставить исследователям с удобным и воспроизводимым устройством для проведения анализа миграции клеток с использованием стандартного 96-луночного культурального пластину.
Introduction
Миграция клеток играет важную роль в клеточных процессах, таких как эмбриогенез, нейрогенез, ангиогенез, заживление ран, слизистых оболочек, эпителиальные ремонт-мезенхимальных-переходов при нормальном развитии и ситуации заболевания 1. Это сложный процесс , который включает в себя координацию многочисленных меж- и внутриклеточных событий , в том числе сигнальных взаимодействий молекул, поляризация клеток, цитоскелета реорганизации, матрицы ремоделирования, мембранного выпячивания и динамическая межклеточной адгезии модуляции 2. Путем изучения миграции клеток, обнаружение и проверка химических веществ или биологических молекул, приводящих к движению клеток и связанных с ней биохимических путей может быть определена. Этот фундаментальный процесс может быть использован с выгодой в качестве прокси-сервера для различных приложений, таких как лечение заболеваний и наркомании таргетинга.
Ранив анализ является одним из клеточной миграции анализов 3. Здесь Anиндивидуальный образец клеток будут частично удалены с помощью механических средств, чтобы произвести обнаженную область, где клетки будут мигрировать, чтобы покрыть область. Процент восстановления в определенный момент времени будет контролироваться. При обработке большого количества образцов, такие вопросы, как экспериментальной стоимости и перекрестного загрязнения в образцах может быть проблематичным. Хотя многие коммерческие инструменты и анализы доступны для изучения миграции клеток 4, 5, 6, многие из них требовали дорогих и сложное оборудование , и все еще необходимы улучшения. По этим причинам, 8-канальный механический ячейки wounder (рисунок 1) разрабатывается.
Наш 8-канальный механический ячейка wounder включила несколько уникальных особенностей в решении вышеуказанных проблем. Это обеспечивает гибкость для выполнения миграции клеток / ранив анализов в формате культуры 96-луночного планшета. Регулируемое гуiding дизайн бар гарантирует, что площадь повреждения находится в центральном положении каждой лунки. Кроме того, высота направляющих стержней может быть отрегулирована таким образом, чтобы wounder применима для различных марок культуральных планшетов. И, наконец, регулируемая конструкция позволяет ранении контактный ровный контакт кончиках пипеток с поверхностью пластины культуры для достижения одновременного и воспроизводимую ранению 7, 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наша ячейка wounder имеет несколько уникальных особенностей в решении проблем традиционной миграции клеток анализов. 8-канальный механический ячейки wounder изготовлен из высококачественной нержавеющей стали (сталь 304) с длительным сроком службы, который можно стерилизовать автоклавирован…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить г Tam Po Leung, г-н Вонг Чи Кин и технический состав факультета Workshop науки, Гонконг Baptist University, за свои технические навыки и консультации в создании прототип этого wounder.
Materials
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A., Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980 (2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
