Maturação de cardiomiócitos estaminais humanas derivadas de células em Biowires Usando Electrical Stimulation
Summary
A plataforma biowire cardíaca é um método in vitro utilizado para amadurecer embrionário humano e cardiomiócitos derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas (HPSC-CM) através da combinação de cultura de células tridimensional com estimulação eléctrica. Este manuscrito apresenta a configuração detalhada da plataforma biowire cardíaca.
Abstract
cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (HPSC-CMS) têm sido uma fonte de células promissor e, assim, encorajados a investigação de suas possíveis aplicações na pesquisa cardíaca, incluindo a descoberta de medicamentos, modelagem de doença, a engenharia de tecidos e medicina regenerativa. No entanto, as células produzidas por protocolos existentes exibir uma gama de imaturidade comparado com cardiomiócitos ventriculares adulto nativas. Muitos esforços têm sido feitos para amadurecer HPSC-CMs, com apenas maturação moderada alcançado até agora. Portanto, um sistema de engenharia, chamado biowire, foi concebida, fornecendo pistas tanto físicas e eléctricas para levar HPSC-MC para um estado mais maduro in vitro. O sistema utiliza uma plataforma microfabricado para semear HPSC-CMs em colagénio do tipo I gel ao longo de um fio de sutura molde rígido para montar em tecido cardíaco alinhados (biowire), que é submetido a estimulação do campo eléctrico com uma frequência progressivamente crescente. Em comparação com os controlos não estimulados,estimulada biowired cardiomiócitos exibem um maior grau de maturação estrutural e electrofisiológica. Tais alterações são dependentes da taxa de estimulação. Este manuscrito descreve em detalhe a concepção e criação de biowires.
Introduction
terapia baseada em celular é uma das mais promissoras e investigados para alcançar cardíaca reparação / regeneração. Ele foi auxiliado por engenharia de tecidos cardíaco e o co-entrega de biomateriais 1, 2. A maioria das fontes celulares disponíveis têm sido estudados em modelos animais para os seus efeitos potencialmente benéficos sobre danificados, doentes, ou corações com idades entre 3. Em particular, os esforços significativos foram feitos para usar células-tronco pluripotentes humanas (HPSC) derivada de cardiomiócitos (HPSC-CM), uma fonte de células autólogas potencialmente ilimitado para a engenharia de tecido cardíaco. HPSC-CMs pode ser produzido usando vários protocolos estabelecidos 4, 5, 6. No entanto, as células obtidas a exibir os fenótipos fetais semelhante, com uma gama de características imaturas em comparação com cardiomiócitos ventriculares do adulto 7, </sup> 8. Isso pode ser um obstáculo para a aplicação de HPSC-CMs como modelos de tecido cardíaco de adultos na pesquisa de descoberta de drogas e no desenvolvimento de adultos modelos de doenças cardíacas 9.
De modo a ultrapassar esta limitação de imaturidade fenotípica, novas abordagens têm sido investigado activamente para promover a maturação de cardiomiócitos. Os primeiros estudos revelaram propriedades pró-maturação eficazes em cardiomiócitos de ratos neonatais através cíclico mecânico 10 ou estimulação eléctrica 11. Compactação do gel e estimulação mecânica cíclico também foram exibidas para melhorar alguns aspectos da HPSC-CM maturação 12, 13, com realce mínimo das propriedades de manuseamento electrofisiológicos e de cálcio. Portanto, um sistema de plataforma chamado "fio biológica" (biowire) foi concebido, fornecendo ambas as pistas estruturais e estimulação do campo eléctricon para melhorar a maturação de HPSC-CMs 14. Este sistema utiliza uma plataforma microfabricado para criar tecido cardíaco alinhados que é passível de estimulação do campo eléctrico. Isso pode ser usado para melhorar a maturidade estrutural e eletrofisiológica da HPSC-CMS. Aqui, descrevemos os detalhes de fazer tais biowires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito descreve a configuração e a implementação da plataforma de engenharia, biowire, para melhorar a maturao de HPSC-CMs. O dispositivo pode ser feito em instalações de microfabricação padrão, e biowires pode ser produzido com técnicas de cultura de células comuns e um estimulador elétrico.
Para nosso conhecimento, não há nenhum método relatado semelhante ao biowires. Esta estratégia revela que a melhoria das propriedades de maturação foram dependentes do regime …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa-in-aid from the Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14-0006265), subvenções de funcionamento dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (137352 e 143066), e um subsídio da Fundação JP Bickell (1013821 ) à SSN.
Materials
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4-inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
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