Maturazione di staminali umane cardiomiociti derivati dalle cellule in Biowires Utilizzando Stimolazione Elettrica
Summary
La piattaforma BIOWIRE cardiaco è un metodo in vitro utilizzato per maturare embrionale umano e cardiomiociti derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte (HPSC-CM) combinando coltura cellulare tridimensionale con stimolazione elettrica. Questo manoscritto presenta la configurazione dettagliata della piattaforma BIOWIRE cardiaco.
Abstract
cardiomiociti derivati dalle cellule staminali umane pluripotenti (HPSC-CMS) sono stati una fonte di cellule promettente e hanno così favorito l'esame delle loro potenziali applicazioni nel campo della ricerca cardiaca, tra cui la scoperta di farmaci, la modellazione della malattia, l'ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. Tuttavia, le cellule prodotte da protocolli esistenti mostrano una serie di immaturità rispetto ai cardiomiociti adulti ventricolare nativi. Molti sforzi sono stati fatti maturare HPSC-CM, con solo la maturazione moderata raggiunto finora. Pertanto, un sistema ingegnerizzato, chiamato BIOWIRE, è stato ideato prevedendo stimoli fisici ed elettrici di condurre HPSC-CM ad uno stato più maturo in vitro. Il sistema utilizza una piattaforma microfabbricazione per seminare HPSC-CM in collagene tipo I gel lungo un modello di sutura rigido da montare nel tessuto cardiaco allineata (BIOWIRE), sottoposto alla stimolazione campo elettrico con una frequenza progressivamente crescente. Rispetto ai controlli non stimolate,stimolati biowired cardiomiociti presentano un maggiore grado di maturazione strutturale ed elettrofisiologico. Tali cambiamenti dipendono dalla frequenza di stimolazione. Questo manoscritto descrive in dettaglio la progettazione e realizzazione di biowires.
Introduction
La terapia a base di cellule è una delle strategie più promettenti e studiati per raggiungere cardiaca riparazione / rigenerazione. E 'stato aiutato da ingegneria dei tessuti cardiaco e il co-fornitura di biomateriali 1, 2. La maggior parte delle fonti di cellule disponibili sono stati studiati in modelli animali per i loro effetti potenzialmente benefici sulla danneggiati, malati, o cuori di età compresa tra 3. In particolare, notevoli sforzi sono stati fatti per usare cellule staminali pluripotenti umane (HPSC) -derived cardiomiociti (HPSC-CM), una fonte di cellule autologhe potenzialmente illimitato per l'ingegneria tissutale cardiaco. HPSC-CM può essere prodotto utilizzando diversi protocolli stabiliti 4, 5, 6. Tuttavia, le cellule ottenute mostrano fenotipi fetali simile, con una serie di caratteristiche immaturi rispetto al cardiomiociti ventricolari adulti 7, </sup> 8. Questo può essere un ostacolo per l'applicazione di HPSC-CMS come modelli di tessuto cardiaco degli adulti nella ricerca scoperta di nuovi farmaci e lo sviluppo di modelli di malattia cardiaca per adulti 9.
Per superare questa limitazione di immaturità fenotipica, nuovi approcci sono stati attivamente studiati per promuovere la maturazione dei cardiomiociti. I primi studi hanno rivelato efficaci proprietà pro-maturazione in cardiomiociti neonatali di ratto tramite ciclico 10 meccanica o stimolazione elettrica 11. Compattazione gel e ciclica stimolazione meccanica stati mostrati anche di migliorare alcuni aspetti della HPSC-CM maturazione 12, 13, con un minimo aumento delle proprietà di manipolazione elettrofisiologiche e di calcio. Pertanto, un sistema piattaforma chiamata "wire biologica" (BIOWIRE) è stato ideato fornendo sia segnali strutturali e campo elettrico stimulation per migliorare la maturazione di HPSC-CM 14. Questo sistema utilizza una piattaforma microfabbricazione per creare tessuto cardiaco allineato che è suscettibile di stimolazione campo elettrico. Questo può essere usato per migliorare la maturità strutturale ed elettrofisiologico di HPSC-CM. Qui, descriviamo i dettagli di tale biowires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto descrive la configurazione e implementazione della piattaforma progettata, BIOWIRE, per migliorare la maturazione di HPSC-CM. Il dispositivo può essere realizzato in impianti di microfabbricazione standard e biowires può essere prodotto con tecniche di coltura cellulare comuni e uno stimolatore elettrico.
A nostra conoscenza, non esiste un metodo simile a quello riportato biowires. Questa strategia rivela che il miglioramento delle proprietà di maturazione sono dipenden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione-in-aiuto del Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14-0.006.265), sovvenzioni di funzionamento dal Canadian Institutes of Health Research (137.352 e 143.066), e una borsa di studio fondazione JP Bickell (1.013.821 ) al SSN.
Materials
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4-inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
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