نضوج الجذعية البشرية العضلية المشتقة من الخلايا في Biowires باستخدام التنبيه الكهربائي
Summary
منصة أسلاك القلب هو وسيلة في المختبر المستخدمة لتنضج الجنينية البشرية والمستحثة الجذعية الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية (هسك-سم) من خلال الجمع بين زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد مع التحفيز الكهربائي. تقدم هذه المخطوطة الإعداد المفصل لمنصة أسلاك القلب.
Abstract
وقد الجذعية المحفزة المشتقة من الخلايا العضلية البشرية (hPSC-CMS) مصدر خلية واعد ووهكذا شجعت التحقيق في التطبيقات المحتملة في مجال البحوث القلب، بما في ذلك اكتشاف المخدرات، والنمذجة المرض، وهندسة الأنسجة والطب التجديدي. ومع ذلك، والخلايا التي تنتجها البروتوكولات القائمة عرض مجموعة من النضج مقارنة مع العضلية البطين الكبار الأم. وقد بذلت الكثير من الجهود لتنضج hPSC-مضادة، مع نضوج المعتدل فقط يتحقق حتى الآن. لذلك، نظام هندسيا، ودعا biowire، وقد وضعت من خلال تقديم العظة على حد سواء الفيزيائية والكهربائية لقيادة hPSC-مضادة إلى حالة أكثر نضجا في المختبر. ويستخدم هذا النظام منصة microfabricated البذور hPSC-مضادة في نوع الكولاجين I هلام على طول الخيط قالب جامد لتجميع في أنسجة القلب الانحياز (biowire)، التي تخضع لتحفيز الحقل الكهربائي مع التكرار المتزايد تدريجيا. مقارنة مع الضوابط nonstimulated،حفز biowired العضلية يحمل درجة محسنة من النضج الهيكلي والكهربية. هذه التغيرات تعتمد على معدل التحفيز. توضح هذه المخطوطة في التفاصيل تصميم وإنشاء biowires.
Introduction
العلاج خلية القاعدة هي واحدة من الاستراتيجيات الواعدة والتحقيق لتحقيق إصلاح القلب / تجديد. تم بمساعدة من قبل هندسة الأنسجة القلبية وشارك في تسليم المواد الحيوية 1 و 2. وقد تم دراسة معظم المصادر خلية المتاحة في النماذج الحيوانية للالتأثيرات الايجابية على التالفة، المريضة، أو قلوب الذين تتراوح أعمارهم بين 3. على وجه الخصوص، وقد بذلت جهودا كبيرة لاستخدام الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSC) -derived العضلية (hPSC-CM)، مصدر خلية ذاتي قد يكون غير محدود لهندسة الأنسجة القلبية. hPSC-مضادة يمكن أن تنتج باستخدام العديد من البروتوكولات المعمول 4 و 5 و 6. ومع ذلك، فإن الخلايا التي تم الحصول عليها عرض الظواهر الجنين مثل، مع مجموعة من الخصائص غير ناضج مقارنة العضلية البطين الكبار 7، </sup> 8. هذا يمكن أن يكون عائقا أمام تطبيق hPSC-مضادة كنماذج من أنسجة القلب الكبار في مجال البحوث اكتشاف المخدرات وفي تطوير نماذج مرض القلب الكبار 9.
ومن أجل التغلب على هذا الحد من عدم النضج المظهري، وقد تم التحقيق في نهج جديدة بنشاط لتعزيز cardiomyocyte النضج. وكشفت الدراسات المبكرة خصائص المؤيدة للنضوج فعالة في العضلية الفئران حديثي الولادة عن طريق دوري الميكانيكية 10 أو التحفيز الكهربائي 11. عرضت الضغط جل والتحفيز الميكانيكي دوري أيضا إلى تحسين بعض جوانب hPSC-CM نضوج 12، 13، مع تعزيز الحد الأدنى من الخصائص التعامل الكهربية والكالسيوم. ولذلك، فقد تم ابتكار نظام منصة تسمى "سلك البيولوجي" (biowire) عن طريق توفير العظة الهيكلية والكهربائية stimulatio الحقلن لتعزيز نضوج hPSC-مضادة 14. يستخدم هذا النظام منصة microfabricated لخلق أنسجة القلب الانحياز التي هي قابلة للتحفيز الحقل الكهربائي. وهذا يمكن أن تستخدم لتحسين النضج الهيكلي والكهربية من hPSC-مضادة. هنا، نحن تصف تفاصيل اتخاذ مثل biowires.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المخطوطة إعداد وتنفيذ المهندسة منصة، biowire، لتحسين نضوج hPSC-مضادة. يمكن جعل الجهاز في مرافق التصنيع الدقيق القياسية، ويمكن أن تنتج biowires مع تقنيات زراعة الخلايا المشتركة ومشجعا الكهربائية.
على حد علمنا، لا توجد طريقة وذكرت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة في والمساعدات من القلب والسكتة الدماغية مؤسسة كندا (G-14-0006265) والمنح التشغيل من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (137352 و 143066)، ومنحة مؤسسة جب بيكيل (1013821 ) إلى SSN.
Materials
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4-inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
