Summary

Maturation des cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines dans la stimulation électrique Biowires utilisant

Published: May 06, 2017
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Summary

La plate – forme BIOWIRE cardiaque est un procédé in vitro utilisé pour arriver à maturité embryonnaire humain et induit des cardiomyocytes dérivés de cellules-souches pluripotentes (HPSC-CM) en combinant la culture de cellules en trois dimensions avec une stimulation électrique. Ce manuscrit présente la configuration détaillée de la plate-forme BIOWIRE cardiaque.

Abstract

Les cardiomyocytes à base de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC-CM) ont été une source cellulaire prometteuse et ont donc encouragé la recherche de leurs applications potentielles dans la recherche cardiaque, y compris la découverte de médicaments, la modélisation de la maladie, l'ingénierie tissulaire et la médecine régénératrice. Cependant, les cellules produites par des protocoles existants présentent une gamme d'immaturité par rapport aux cardiomyocytes ventriculaires adultes adultes. De nombreux efforts ont été faits pour maturité des HPSC-CM, avec une maturation modérée atteinte jusqu'ici. Par conséquent, un système d'ingénierie, appelé biowire, a été conçu en fournissant des indices physiques et électriques pour conduire les CMH-CM à un état plus mature in vitro . Le système utilise une plate-forme microfabricée pour semer les hPSC-CM dans le gel de collagène de type I le long d'une suture de modèle rigide pour assembler en tissu cardiaque aligné (biowire), qui est soumis à une stimulation de champ électrique avec une fréquence progressivement croissante. Par rapport aux contrôles non stimulés,stimulées biowired cardiomyocytes présentent un degré accru de maturation structurelle et électrophysiologiques. Ces changements dépendent du taux de stimulation. Ce manuscrit décrit en détail la conception et la création de biowires.

Introduction

la thérapie à base de cellules est l'une des stratégies les plus prometteuses et une enquête pour parvenir à la réparation / régénération cardiaque. Il a été aidé par l' ingénierie tissulaire cardiaque et la co-livraison de 1, 2 biomatériaux. La plupart des sources cellulaires disponibles ont été étudiés dans des modèles animaux pour leurs effets potentiellement bénéfiques sur endommagés, malades ou âgés de 3 coeurs. En particulier, des efforts importants ont été faits pour utiliser les cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) cardiomyocytes (HPSC dérivée de-CM), une source de cellules autologues potentiellement illimitée pour l'ingénierie tissulaire cardiaque. HPSC-CMS peut être produite en utilisant plusieurs protocoles établis 4, 5, 6. Cependant, les cellules obtenues présentent des phénotypes de type foetaux, avec une gamme de caractéristiques immatures par rapport à des cardiomyocytes ventriculaires adultes 7, </sup> 8. Cela peut être un obstacle à l'application de HPSC- en tant que modèles de CMs tissu cardiaque adulte dans la recherche de la découverte de médicaments et dans le développement de modèles de maladies cardiaques adultes 9.

Afin de surmonter cette limitation de l'immaturité phénotypiques, de nouvelles approches ont été étudiées activement pour favoriser la maturation des cardiomyocytes. Les premières études ont révélé des propriétés efficaces pro-maturation dans les cardiomyocytes de rats nouveau – nés par mécanique cyclique 10 ou la stimulation électrique 11. Le compactage du gel et de la stimulation mécanique cyclique ont été montrés également à améliorer certains aspects de la maturation HPSC-CM 12, 13, avec la mise en valeur minimale des propriétés de manipulation et de calcium électrophysiologiques. Par conséquent, un système de plate-forme appelée « fil biologique » (de BIOWIRE) a été conçu en fournissant les deux signaux de structure et champ électrique stimulationn pour améliorer la maturation des HPSC-CM 14. Ce système utilise une plate-forme microfabriqué pour créer un tissu cardiaque alignés qui se prête à une stimulation de champ électrique. Cela peut être utilisé pour améliorer la maturité structurelle et électrophysiologique de HPSC-Cms. Nous décrivons ici les détails de fabrication de ces biowires.

Protocol

1. Maître Conception et fabrication REMARQUE: Utilisez la lithographie douce pour la fabrication de l'appareil. Faire un SU-8 à deux couches maître pour le moulage de polydiméthylsiloxane (PDMS). Concevoir l'appareil à l' aide d' un logiciel de conception et de rédaction (figure 1A, gauche). Dessiner chaque couche du maître séparément. Imprimer la conception du dispositif sur deux photomasques à 20.000 dpi, correspondant aux deux couches …

Representative Results

La raison pour l'utilisation d'un fil de suture dans les biowires est de servir de matrice pour la formation de constructions en 3D qui correspondent à un axe et imitent la forme de fibres cardiaques. Nous montrons que , après sept jours de culture dans le BIOWIRE, les cellules remodelés le gel autour de la suture (figure 3A). Les cellules assemblées le long de l'axe de la suture pour former un tissu cardiaque alignés (figure 3). Après …

Discussion

Ce manuscrit décrit l'installation et la mise en œuvre de la plate-forme d'ingénierie, biowire, pour améliorer la maturation des CMH-CM. Le dispositif peut être fabriqué dans des installations de microfabrication standard, et les biowires peuvent être produits avec des techniques communes de culture cellulaire et un stimulateur électrique.

À notre connaissance, il n'y a pas de méthode rapportée semblable à celle de Biowires. Cette stratégie révèle que les propriét…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention de l'État du cœur et la Fondation des maladies du Canada (G-14-0006265), les subventions de fonctionnement des Instituts de recherche en santé (137352 et 143066), et une subvention de la Fondation JP Bickell (1.013.821 ) à SSN.

Materials

L-Ascorbic acid Sigma A-4544 hPSC-CM culture media componet
AutoCAD Autodesk, Inc Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail BD Biosciences 354249 Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I  Sigma C0130 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I) EMD Millipore 260913-25MU Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) Dremel Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator Grass s88x
Fetal bovine serum (FBS) WISENT Inc. 080-450
D-(+)-Glucose  Sigma G5767 Collagen gel component
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
H2O MilliQ 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES Sigma H4034 Collagen gel component
Hot plate Torrey Pines HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053
Mask aligner EVG  EVG 620
Matrigel, growth factor reduced  Corning 354230 Collagen gel component
Medium 199 (M199) Thermo Fisher Scientific 11150059 Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG) Sigma M-6145 hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker VWR 89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific 15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+  Thermo Fisher Scientific 14040133
Plate (6-well) Corning 353046
Plate (6-well), low attachment Corning 3471
Platinum wires, 0.2 mm Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Doe & Ingalls Inc. To develop the wafer
Pouch, peel-open Convertors 92308 For steam sterilization
Silicon wafer, 4-inch UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761 Collagen gel component
Sodium hydroxide Sigma S8045 Collagen gel component
Sprin coater Specialty Coating Systems G3P-8
StemPro-34 culture medium Thermo Fisher Scientific 10639011 hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media  Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50  MicroChem Corp. photoresist, master component
SU-8 2050  MicroChem Corp. photoresist, master component
Transferrin Roche 10-652-202 hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25% Thermo Fisher Scientific 25200056 hPSC-CM culture media componet
Wash medium IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin

References

  1. Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
  2. Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
  3. Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
  4. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
  5. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  6. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  7. Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
  8. Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
  9. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  10. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
  11. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
  12. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
  13. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  14. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  15. Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
  16. Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
  17. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
  18. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
  19. Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).

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Cite This Article
Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).

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