Созревание стволовых клеток человека, полученных кардиомиоцитов в Biowires Использование электрической стимуляции
Summary
Сердца biowire платформа является методом в пробирке используется для зрелых человеческих эмбриональных и индуцированных клеток , полученных кардиомиоцитов плюрипотентных стволовых (HPSC-CM) путем объединения трехмерного культивирования клеток с электрической стимуляцией. Эта рукопись представляет подробную установку сердечной biowire платформы.
Abstract
Человека плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоциты (HPSC-КМВ) был многообещающим источником клеток и таким образом поощрять исследование их потенциальных применений в сердечной исследований, в том числе открытия новых лекарств, моделирование болезни, тканевой инженерии и регенеративной медицины. Однако, клетки, полученные существующими протоколами показывают диапазон незрелости по сравнению с носителями взрослых желудочковых кардиомиоцитов. Много усилий было сделано, чтобы созреть HPSC-КМВ, с умеренным созревании достиг до сих пор. Таким образом, разработано система, названная biowire, была разработана путем предоставления как физические и электрических сигналов , чтобы привести HPSC-CMs к более зрелому состоянию в пробирке. Система использует платформу микроизготовленной семени HPSC-CMs в коллагене типа I гелеобразованию вдоль жесткого шаблона шовного материала, чтобы собрать в выровненную ткань сердца (biowire), который подвергается воздействию электрического поля стимуляции с постепенно возрастающей частотой. По сравнению с нестимулированным управлением,стимулировал biowired кардиомиоцитов проявляют повышенную степень структурного и электрофизиологического созревания. Такие изменения зависят от скорости стимуляции. Эта рукопись подробно описывает конструкцию и создание biowires.
Introduction
Клеточная терапия является одним из наиболее перспективных и исследуемых стратегий для достижения сердца ремонта / восстановления. Это было облегчено инженерии сердечной ткани и совместной доставки биоматериалов 1, 2. Большинство доступных источников клеток, были изучены на животных моделях для их потенциально благотворное воздействие на поврежденные, больные, или престарелыми сердца 3. В частности, значительные усилия были предприняты, чтобы использовать человеческие плюрипотентные стволовые клетки (HPSC) -derived кардиомиоцитов (HPSC-CM), потенциально неограниченный источник аутологичных клеток для инженерии сердечной ткани. HPSC-МС может быть получен с использованием нескольких установленных протоколов 4, 5, 6. Однако полученные клетки обладают эмбриональными-подобными фенотипами, с диапазоном незрелых характеристик по сравнению со взрослыми желудочковых кардиомиоцитов 7, </sup> 8. Это может быть препятствием для применения HPSC-CMs в качестве моделей взрослой ткани сердца в исследовании обнаружения наркотиков и в развитии взрослых сердечных моделей заболеваний 9.
Для того, чтобы преодолеть это ограничение фенотипической незрелости, новые подходы активно исследуются в целях содействия кардиомиоцитов созреванию. Ранние исследования показали , эффективные свойства про-созревания в неонатальных кардиомиоцитов крыс с помощью циклического механического 10 или электрической стимуляции 11. Гель для уплотнения и циклическое механическое раздражение также показали , чтобы улучшить некоторые аспекты HPSC-CM созревания 12, 13, с минимальным усилением электрофизиологических и кальцием свойств обработки. Таким образом, система платформы называется «биологическая провод» (biowire) была разработана путем предоставления как структурных сигналов и электрическое поле stimulatioп для повышения созревания HPSC-МС 14. Эта система использует микроизготовленную платформу для создания выровненной сердечной ткани, которая поддается электрической стимуляция поля. Это может быть использовано для улучшения структурных и электрофизиологические зрелостей HPSC-CMs. Здесь мы описываем деталь изготовления такого biowires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта рукопись описывает установку и внедрение спроектированной платформы, biowire, чтобы улучшить созревание HPSC-CMs. Устройство может быть выполнено в стандартных объектах микрообработки, и biowires может быть получен с обычными методами клеточной культуры и электрическим стимулятором.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом-в-помощь от сердца и инсульта Фонда Канады (G-14-0006265), операционные гранты от Канадского института исследований в области здравоохранения (137352 и 143066) и грантом фонда Джп Бикелл (1013821 ) к ССН.
Materials
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4-inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
