السيطرة التعبير قناة ايون من خلال ترنسفكأيشن عابر محرض
Summary
أصبح يدرس القنوات الأيونية من خلال نظام معربا عن heterologously تقنية الأساسية في البحوث الطبية الحيوية. في هذه المخطوطة، فإننا نقدم وسيلة فعالة وقت لتحقيق رقابة مشددة التعبير القناة الايونية عن طريق أداء ترنسفكأيشن عابرة تحت سيطرة المروج محرض.
Abstract
ترنسفكأيشن، وتسليم من الأحماض النووية الأجنبية في خلية، هو أداة قوية في مجال البحوث البروتين. من خلال هذه الطريقة، يمكن التحقيق القنوات الأيونية من خلال تحليل الكهربية، وتوصيف الكيمياء الحيوية، ودراسات طفرية، وتأثيرها على العمليات الخلوية. تعداء عابرة تقدم بروتوكول بسيط في الذي يصبح فيه البروتين المتاحة للتحليل في غضون بضع ساعات إلى أيام. على الرغم من أن يقدم هذا الأسلوب بروتوكول كفاءة واضحة والوقت نسبيا، واحدة من العناصر الأساسية ومعايرة التعبير عن الجينات التي تهم المستويات ذات الصلة الفسيولوجية أو المستويات التي هي مناسبة للتحليل. تحقيقا لهذه الغاية، وقد ظهرت العديد من الطرق المختلفة التي توفر القدرة على التحكم في التعبير عن الجينات في المصالح. توفر عدة مستقرة بروتوكولات خلية ترنسفكأيشن وسيلة لإدخال دائمة الجين في الجينوم الخلوي تحت تنظيم وtranscrip التي تسيطر عليها التتراسيكلينتفعيل tional. في حين أن هذا الأسلوب تنتج مستويات التعبير موثوق بها، كل الجينات في المصالح يتطلب بضعة أسابيع من العمل المهرة بما في ذلك معايرة منحنى القتل، واختيار من مستعمرات الخلايا، وأكثر عموما الموارد. هنا نقدم البروتوكول الذي يستخدم ترنسفكأيشن عابرة من المحتمل قناة الموجبة أعضاء فصيلة V جينات مستقبلات عابر 1 (TRPV1) في نظام محرض وسيلة فعالة للتعبير عن البروتين في الطريقة التي تسيطر عليها والتي لا غنى عنها في تحليل القناة الايونية. علينا أن نظهر أن استخدام هذه التقنية، ونحن قادرون على أداء التصوير الكالسيوم، خلية كاملة، وتحليل قناة واحدة مع مستويات قناة تسيطر المطلوبة لكل نوع من جمع البيانات مع ترنسفكأيشن واحد. وعموما، هذا يوفر تقنية قابلة للتكرار والتي يمكن استخدامها لدراسة هيكل القنوات الأيونية وظيفة.
Introduction
معربا عن Heterologously أنظمة هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لدراسة العديد من الوظائف الخلوية 1. جعلت لها الانظار الذاتية البروتين، ومتطلبات الحد الأدنى من الصيانة، والنمو موثوق بها، والقدرة على تناول وتعبير عن الحمض النووي الأجانب خطوط الخلايا مثل الجنينية البشرية الكلى (HEK293) والصينية الهامستر المبيض (CHO) تقريبا من الضروري ان الأبحاث البيولوجية 2 و 3. وتشمل مجالات البحث باستخدام أنظمة مغاير بروتينات الغشاء، مما يشير الى داخل الخلايا، والنشاط الأنزيمي. بعد ترنسفكأيشن من الحمض النووي الأجانب إلى داخل الخلية، والعديد من أشكال مختلفة من التحليل يمكن أن يؤديها، بما في ذلك الكهربية، والتصوير الكالسيوم ratiometric، لطخة غربية، الخ 4، 5.
ويرجع ذلك إلى مجموعة واسعة من التطبيقات المحتملة للأنظمة تعبير مغايرة، وكثير من احوقد وضعت الكواشف والمنتجات الشمالي للاستفادة من هذه الخلايا وصفاتهم 6. نظم تسليم الحمض النووي التي عابر أو دائم دمج الحمض النووي الأجانب إلى داخل الخلايا لدراسة البروتين دخيلة أصبحت واحدة من أكثر الأدوات شعبية ومفيدة للبحث البيولوجي. وبشكل أكثر تحديدا، ويستخدم على نطاق واسع transfecting عابر الحمض النووي في الخلية على أنها عملية بسيطة، مباشرة إلى الأمام التي تتطلب القليل نسبيا من الوقت والمواد. وعلاوة على ذلك، فإن نسبة النجاح من الخلايا التي تخضع ترنسفكأيشن مرتفع 7. هذه التقنية هي موثوقة جدا عندما جنبا إلى جنب مع الجين علامة مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، ويمكن استخدامها في العديد من التقنيات المختلفة مثل التصوير الكالسيوم والكهربية 5. للأسف، على الرغم من، معربا عن عابر الحمض النووي في الخلايا المضيفة يأتي مع بعض العثرات الرئيسية، وليس في الأقل مستوى التعبير في الخلية لا يمكن الاعتماد عليها. عدد النسخ من البلازميد اتخذت شص في الخلية لا يمكن السيطرة عليها، وبالتالي فإن التعبير بين التجارب الفردية يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا 2. تصبح هذه قضية هامة عند أي محاولة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية، أو أداء تقنيات دقيقة لجمع البيانات.
كحل للمضاعفات المذكورة أعلاه، وقد تم تصميم بروتوكولات ترنسفكأيشن مستقرة يمكن من خلالها إدخال الجين في جينوم الخلية تحت رقابة مشددة من المروج محرض، مثل نظام التتراسيكلين التعبير كاظمة، وضمان واحد نسخة من البلازميد يدمج في جينوم كل خلية، ويعبر عنها إلا بعد تحريض آلية النسخ، على سبيل المثال، في حضور الدوكسيسيكلين. في حين أن هذا لا يحل العقبات من مستويات بروتين تعبير متناسقة، يفقد هذه الطريقة راحة بروتوكول سريعة وبسيطة نسبيا من تعداء عابر. إنشاء خط الخلية مستقرة يأخذ أسابيع قليلة على الأقل في حركتيح واحد يجب معايرة منحنى قتل من قبل المضادات الحيوية المحددة للحفاظ على التعبير البروتين وضمان التكامل بين ناقلات وبمهارة تحديد وتنمو المستعمرات الخلية. عموما هذا يأخذ مزيدا من الوقت والجهد مع انخفاض نسبة النجاح 8.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول المتوسطة التي تعتمد على نقاط القوة في كل من الخيارات ترنسفكأيشن شعبية لتوفير وسيلة بسيطة وفعالة للسيطرة على مستويات التعبير في أي خط الخلية محرض. مع الحفاظ على الخلايا مع نظام تيت محرض، نحن عابر transfect لدينا الجينات في المصالح، عابر مستقبلات المحتملة قناة الموجبة أعضاء فصيلة V 1 (TRPV1)، ligated في ناقلات التي يمكن أن تجمع بين homologously مع نظام قامع. وبهذه الطريقة، يمكن إدخال الجين في الخلايا دون بدأوا يعبرون. فقط مع إضافة الدوكسيسيكلين لم تبدأ الجينات للتعبير، مما يسمح لنا لمعايرة مستويات البروتين EXPRession وفقا لتقنية أو المستويات التي سجلت في الظروف الفسيولوجية. كما يتجنب بروتوكول لدينا مضاعفات طويلة المرتبطة توليد خط خلية التعبير عن ثابت. نبدأ من خلال إظهار تغير مستويات تفعيل TRPV1 في التصوير الكالسيوم من الامم المتحدة التي يسببها من خلال أربع ساعات من تحريض وكيف ارتفاع مستويات الكالسيوم داخل الخلايا يرتبط. نحن ثم تكرار البروتوكول في تكوين خلية كاملة من تقنية المشبك التصحيح، والتي تبين تيار متزايد مع زيادة الوقت من الاستقراء. وأخيرا، فإننا نقدم أمثلة من التسجيلات الكهربية قناة واحدة، وتبين أن هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للتعبير تسيطر عليها عندما تبحث عن جمع البيانات الدقيقة على أساس الوحدات الفردية من البروتين. من خلال بروتوكول لدينا، ونحن نقدم وسيلة مريحة للسيطرة على التعبير البروتين في النظم مغاير مع تجنب المضاعفات زراعة الخلايا طويلة، وبالتالي توفير وسيلة للسيطرة على الأوضاع بين التجارب وتوفير موإعادة النتائج قابلة للتكرار.
Protocol
Representative Results
Discussion
ترنسفكأيشن هو بروتوكول يستخدم على نطاق واسع للتعبير البروتين والبحوث، مع العديد من الأشكال المختلفة لتحسين الاتساق التعبير والاستقرار. توفر الكواشف ترنسفكأيشن عابرة بسيطة وسهلة لاستخدام بروتوكول حيث يمكن تحليل الخلايا والبروتين من الفائدة خلال ساعات ليلة وضحاها …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم اسرائيل [المنح 1721-1712، 1368-1312، و1444-1416] (لا ف ب). ويتبع AP مع مركز Brettler وديفيد ر مركز بلوم، كلية الصيدلة، جامعة العبرية في القدس.
Materials
| pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102020 | |
| pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V103320 | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Swift™ MaxPro Thermal Cycler | Esco | n.a | |
| Restriction Enzymes | ThermoScientific Fisher | ER0501 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoScientific Fisher | ND-2000C | |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific Fisher | EL0011 | |
| One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli | ThermoScientific Fisher | C404006 | |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Bio | A-301-5 | |
| Tryptone for microbiology | Merck | 6.19305E+13 | |
| Yeast Extract | BD worldwide | 212750 | |
| SIF6000R Incubated Shaker | LAB COMPANION | 45H118 | |
NucleoSpin®plasmid |
Macherey Nagel | 740588.25 | |
| MS 300V Power Supply | Major Science | MP-300V | |
| Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System | ThermoScientific Fisher | B1A | |
| T-REx™-293 cell line | Invitrogen | R710-07 | |
| DMEM (1X), liquid (high glucose) | Gibco | 41965-039 | |
| HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
| ApaI | NEB | R0114S | |
| CutSmart® Buffer | NEB | B7204S | |
| pcDNA™6/TR Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102520 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco | 10270106 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) | Biological Industries | 03-022-1B | |
| Heracell™ 150i CO2 Incubator | ThermoScientific Fisher | 51026406 | |
| MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet | ThermoScientific Fisher | 51025411 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER | Hausser Scientific | 31000 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| TransIT®-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round | Knittel Glass | GG-12 | |
| BioCoat™ Poly-D-Lysine | Corning | 354210 | |
| Water, Cell Culture Grade | Biological Industries | 03-055-1A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Fura-2, AM ester | Biotium | BTM-50034 | |
| Pluronic® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| µ-Slide 8 Well | ibidi | 80826 | |
| (E)-Capsaicin | Tocris | 462 | |
| Olympus IX70 Fluorescence Microscope | Olympus | n.a | |
| Lambda DG-4 Wavelength Switcher | Sutter Instruments | n.a | |
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera | QImaging | n.a | |
| MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software | Molecular Devices | n.a | |
| Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
| Standard Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MF-900 Microforge | NARISHIGE | n.a | |
| ValveBank perfusion sysytem | AutoMate Scientific | ||
| Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System | Molecular Devices | n.a | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | n.a | |
| pCLAMP 10.6 Software | Molecular Devices | n.a | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 |
References
- Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization. Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Xu, X., Nagarajan, H., et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
- Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry. Scientific reports. 5, 12278 (2015).
- Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics. Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells. Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain. Cell. 141 (5), 834-845 (2010).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).
- Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels. J Vis Exp. (71), e4209 (2013).
