Управляемая Expression ионного канала через Индуцибельные временная трансфекция

Гетерологично экспрессирующих систем является одним из наиболее широко используемых методов для изучения множества клеточных функций ^1. Их низкая эндогенный белковый профиль, минимальные требования к техническому обслуживанию, надежный рост, и способность принимать и экспрессии чужеродной ДНК сделали клеточные линии , такие как эмбриональной почки человека (HEK293) и яичника китайского хомячка (СНО) почти существенное значение для биологических исследований , ^{2, 3.} Направления исследований с использованием систем гетерологичной включают мембранные белки, внутриклеточный сигнализацию и ферментативную активность. После трансфекции чужеродной ДНК в клетку, множество различных форм анализа могут быть выполнены, в том числе и электрофизиологических, логометрической визуализации кальция, вестерн – блоттинга и т.д. ^{4, 5.}

Благодаря широкому спектру потенциальных приложений для гетерологичных систем экспрессии, многие differeнт реагенты и продукты были разработаны , чтобы использовать эти клетки и их свойства ^6. Системы доставки ДНК, которая транзиторно или постоянно интегрируют чужеродной ДНК в клетки для изучения экзогенный белок стал одним из самых популярных и полезных инструментов для биологических исследований. Более конкретно, скоротечно трансфекцию ДНК в клетку широко используется в качестве простой, прямой процесс, который требует относительно мало времени и материалов. Кроме того, вероятность успеха клеток , которые подвергаются трансфекции высок ^7. Этот метод очень надежным в сочетании с маркерным геном , такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), и может быть использован для множества различных методов , таких как изображения кальция и электрофизиологических ^5. К сожалению, хотя, скоротечно экспрессии ДНК в клетки-хозяева приходит с некоторыми крупными ловушками, ни в малейшей степени, что уровень экспрессии в клетке является недостоверной. Число копий ДНК плазмиды взяты Uр на одну клетку неуправляема, таким образом , выражение между отдельными экспериментами может сильно различаться ^2. Эта проблема становится существенной, когда либо пытается повторить физиологические условия, или при выполнении точных методов сбора данных.

В качестве решения осложнений, упомянутых выше, стабильные протоколы трансфекции были разработаны, в котором ген, представляющий интерес может быть вставлена ​​в геном клетки под жестким контролем индуцируемого промотора, такого как система экспрессии репрессор тетрациклина, что обеспечивает единый копия плазмиды интегрирует в геном каждой клетки и выражается только после индукции механизма транскрипции, например, в присутствии доксициклина. В то время как это решает препятствия непоследовательных уровней экспрессии белка, этот метод теряет удобство быстрой и относительно простой протокол переходных трансфекциях. Создание стабильной клеточной линии занимает по меньшей мере несколько недель в whicч необходимо откалибровать кривую убийства набор специфическими антибиотиками, чтобы поддерживать экспрессию белка и обеспечивают интеграцию вектора и умело выбирать и выращивать клеточные колонии. В целом , это занимает значительно больше времени и усилий с более низкой вероятностью успеха ^8.

Здесь мы вводим промежуточный протокол, который опирается на сильные стороны обоих популярных вариантов трансфекции, чтобы обеспечить простой и эффективный способ контролировать уровни экспрессии в любой индуцируемого клеточной линии. Сохраняя клетки с индуцибельной системой ТЕТ мы скоротечно трансфекцию наш интерес ген, потенциальные катиона канала подсемейства V элемент 1 (TRPV1) Переходный рецепторной лигируют в вектор, который может гомологичной в сочетании с системой репрессора. Таким образом, ген может быть введен в клетки, не имеющие начала выражать. Только с добавлением доксициклин делает ген начинают выражать, что позволяет калибровать уровни белка выражession в соответствии с методикой, или уровней, наблюдаемое в физиологических условиях. Наш протокол также позволяет избежать длительных осложнений, связанных с формированием стабильно экспрессирующей клеточной линии. Мы начинаем показывать изменяющиеся уровни активации TRPV1 в визуализации кальция из ун-индуцированных через четыре часа индукции и, как повышение уровня внутриклеточного кальция коррелирует. Затем мы дублируем протокол в конфигурации всей ячейки техники патч зажима, показывающий увеличением тока с увеличением времени индукции. И, наконец, мы приводим примеры отдельных записей электрофизиологических канала, и показывают, что эта методика особенно полезна для контролируемого выражения при поиске точного сбора данных на основе отдельных единиц белка. С помощью нашего протокола, мы предлагаем удобный способ контролировать экспрессию белка в гетерологичных системах, избегая длительных осложнений культивирования клеток, обеспечивая тем самым способ контролировать условия между экспериментами и обеспечить моповторно воспроизводимые результаты.