Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Heteroloog tot expressie systemen is een van de meest gebruikte technieken om een veelheid aan cellulaire functies ¹ bestuderen. Hun lage endogene eiwit profiel, minimale onderhoud, betrouwbare groei, en het vermogen om op te nemen en uit te drukken vreemd DNA hebben cellijnen zoals humane embryonale nier (HEK293) en Chinese hamster ovarium (CHO) bijna essentieel voor biologisch onderzoek ^{2, 3} gemaakt. Gebieden van onderzoek met behulp van heterologe systemen omvatten membraaneiwitten, intracellulaire signalering en enzymatische activiteit. Na transfectie van vreemd DNA in de cel, kan veel verschillende vormen van analyse worden uitgevoerd, waaronder elektrofysiologie, calcium ratiometrische imaging, western blot, etc. ^{4, 5.}

Vanwege het brede scala aan mogelijke toepassingen voor heterologe expressie systemen, veel different reagentia en producten zijn ontwikkeld om deze cellen en hun kwaliteiten ⁶ gebruiken. DNA levering systemen die kortstondig of permanent vreemd DNA te integreren in de cellen om exogeen eiwit studeren is uitgegroeid tot een van de meest populaire en handige tools voor het biologisch onderzoek. Meer specifiek wordt tijdelijk transfecteren van DNA in een cel op grote schaal gebruikt als een eenvoudige, eenvoudig proces dat relatief weinig tijd en materiaal vergt. Bovendien, het slagingspercentage van cellen die transfectie ondergaan hoog is ^7. Deze techniek is zeer betrouwbaar in combinatie met een merkergen zoals groen fluorescent eiwit (GFP), en kan worden gebruikt voor veel verschillende technieken zoals calcium imaging en elektrofysiologie ^5. Helaas echter tijdelijk expressie brengen van DNA in gastheercellen geleverd met een aantal valkuilen, niet in het minst het expressieniveau per cel is onbetrouwbaar. Het aantal kopieën van het plasmide-DNA genomen up per cel oncontroleerbaar, waardoor de uitdrukking tussen afzonderlijke experimenten kan sterk variëren ^2. Deze kwestie wordt significant wanneer ofwel een poging om fysiologische omstandigheden te repliceren, of het uitvoeren van nauwkeurige dataverzamelingstechnieken.

Als oplossing voor de bovengenoemde stabiele transfectie protocollen ontworpen zijn complicaties waarin een gen van interesse in het genoom van een cel onder strenge controle van een induceerbare promoter, kan worden ingebracht, zoals een tetracycline repressor expressiesysteem, waardoor een kopie van de plasmide geïntegreerd in het genoom van elke cel en wordt alleen tot expressie gebracht na inductie van de transcriptie mechanisme, bijvoorbeeld in aanwezigheid van doxycycline. Hoewel dit lost de obstakels van inconsistente eiwit expressie levels, deze methode verliest het gemak van een snelle en relatief eenvoudig protocol van voorbijgaande transfecties. De oprichting van een stabiele cellijn duurt minstens een paar weken in whicfoon moet doden kromme specifieke antibiotica ingesteld op de eiwitexpressie stand te houden en integratie van de vector uitstekend selecteren en groeien celkolonies kalibreren. Over het algemeen neemt dit aanzienlijk meer tijd en moeite met een lagere slagingspercentage ^8.

Hier introduceren we een tussenliggende protocol dat is gebaseerd op de sterke punten van beide van de populaire transfectie opties om een ​​eenvoudige en effectieve manier om uitdrukking te beheersen in elke induceerbare cellijn te verschaffen. Met behoud van cellen met tet induceerbare systeem, we tijdelijk transfecteren onze gen van belang, Transient Receptor Potential kationenkanaal subfamilie V lid 1 (TRPV1), geligeerd in een vector die homoloog kan combineren met de repressor systeem. Op deze wijze kan het gen in de cellen worden ingevoerd zonder beginnen te drukken. Alleen met de toevoeging van doxycycline heeft het gen begint te drukken, zodat we het eiwitgehalte expr kalibrerensessieschijven volgens de techniek of niveaus waargenomen bij fysiologische omstandigheden. Ons protocol vermijdt ook langdurige complicaties in verband met het genereren van een stabiel tot expressie cellijn. We beginnen met het tonen van de veranderende niveaus van TRPV1 activering in calcium beeldvorming van-un geïnduceerd door middel van vier uur van de inductie en hoe de stijging in de intracellulaire calcium niveaus correleert. Vervolgens hebben we dupliceren het protocol in de gehele cel configuratie van de patch clamp techniek, met de toenemende stroom met toenemende tijd van inductie. Tenslotte, laten we voorbeelden van enkel kanaal elektrofysiologie opnamen en tonen dat deze techniek is bijzonder bruikbaar voor gecontroleerde expressie bij het zoeken naar exacte gegevensverzameling op basis van individuele eenheden van het eiwit. Door middel van ons protocol, bieden wij een handige manier om eiwit expressie in heterologe systemen aan te sturen terwijl het vermijden van langdurige celkweek complicaties, aldus een manier om de omstandigheden tussen de experimenten en bieden mo controleopnieuw reproduceerbare resultaten.