Contrôlable Expression Ion canal par transfection transitoire inductible

Systèmes exprimant hétérologue est l' une des techniques les plus couramment utilisées pour étudier une multitude de fonctions cellulaires ^1. Leur faible profil endogène des protéines, un minimum d'entretien, la croissance fiable, et la capacité de prendre et d' exprimer l' ADN étranger ont fait des lignées cellulaires telles que rein embryonnaire humain (HEK293) et ovaire de hamster chinois (CHO) presque indispensable à la recherche biologique ^{2, 3.} Les domaines de recherche en utilisant des systèmes hétérologues comprennent des protéines membranaires, la signalisation intracellulaire, et l'activité enzymatique. Après la transfection d'ADN étranger dans la cellule, de nombreuses formes différentes d'analyse peuvent être effectués, y compris l' électrophysiologie, l' imagerie calcique ratiométrique, western blot, etc. ^{4, 5.}

En raison de la vaste gamme d'applications potentielles pour les systèmes d'expression hétérologues, beaucoup différedes réactifs et des produits nt ont été développés pour utiliser ces cellules et leurs qualités ^6. systèmes de délivrance d'ADN qui transitoirement ou définitivement intégrer l'ADN étranger dans des cellules pour étudier la protéine exogène est devenu l'un des outils les plus populaires et utiles pour la recherche biologique. Plus précisément, la transfection transitoire d'ADN dans une cellule est largement utilisé comme un processus simple et directe qui nécessite relativement peu de temps et de matériaux. En outre, le taux de succès des cellules qui subissent une transfection ⁷ est élevée. Cette technique est très fiable lorsqu'elle est associée à un gène marqueur tel que la protéine fluorescente verte (GFP), et peut être utilisé pour de nombreuses techniques différentes telles que l' imagerie du calcium et ⁵ électrophysiologie. Malheureusement, cependant, exprimant de manière transitoire l'ADN dans des cellules hôtes est livré avec quelques écueils majeurs, pas le moins que le niveau d'expression par cellule est peu fiable. Le nombre de copies d'ADN de plasmide prise up par cellule est incontrôlable, donc l'expression entre les expériences individuelles peut varier considérablement ^2. Cette question devient importante lorsque l'essayer de reproduire les conditions physiologiques, ou d'effectuer des techniques de collecte de données précises.

En tant que solution aux complications mentionnées ci-dessus, des protocoles de transfection stables ont été conçues dans lesquelles un gène d'intérêt peut être inséré dans le génome d'une cellule sous le contrôle étroit d'un promoteur inductible, tel qu'un système de tetracycline répresseur de l'expression, assurant une seule copie du plasmide intègre dans le génome de chaque cellule et est exprimé uniquement après l'induction du mécanisme de transcription, par exemple, en présence de doxycycline. Bien que cela résout les obstacles de niveaux d'expression de protéines incompatibles, cette méthode perd la commodité du protocole rapide et relativement simple de transfections transitoires. L'établissement d'une lignée cellulaire stable prend au moins quelques semaines à which on doit étalonner une courbe de mise à mort fixé par des antibiotiques spécifiques pour maintenir l'expression de protéines et d'assurer l'intégration du vecteur et habilement sélectionner et cultiver des colonies de cellules. Dans l' ensemble cela prend beaucoup plus de temps et d' effort avec un taux de réussite inférieur ^8.

Ici, nous présentons un protocole intermédiaire qui appuie sur les points forts des deux options de transfection populaires pour fournir un moyen simple et efficace pour contrôler les niveaux d'expression dans toute lignée cellulaire inductible. Tout en conservant les cellules avec un système Tet inductible, nous transfecter transitoirement notre gène d'intérêt, le récepteur transitoire canal cationique sous-famille V membre potentiel 1 (TRPV1), ligaturé dans un vecteur qui peut se combiner avec l'homologue système répresseur. De cette manière, le gène peut être introduit dans les cellules sans commencer à exprimer. Seulement avec l'ajout de doxycycline ne le gène commence à exprimer, ce qui nous permet d'étalonner les niveaux de protéines expression selon la technique ou à des niveaux observés dans des conditions physiologiques. Notre protocole permet également d'éviter de longues complications associées à la génération d'une lignée cellulaire exprimant de manière stable. Nous commençons par montrer l'évolution des niveaux d'activation de TRPV1 en imagerie de calcium à travers quatre heures d'induction et comment la hausse des taux de calcium intracellulaire est corrélée induite non. Nous avons ensuite dupliquer le protocole dans la configuration cellule entière de la technique du patch clamp, montrant le courant augmente avec le temps de l'induction de plus en plus. Enfin, nous présentons des exemples d'enregistrements individuels d'électrophysiologie de canal, et de montrer que cette technique est particulièrement utile pour l'expression contrôlée lors de la recherche pour la collecte de données précises sur la base de différentes unités de la protéine. Grâce à notre protocole, nous offrons un moyen pratique pour contrôler l'expression des protéines dans des systèmes hétérologues, tout en évitant de longues complications de culture cellulaire, fournissant ainsi un moyen de contrôler les conditions entre les expériences et fournir des more des résultats reproductibles.