Génération de fusions de protéines fluorescentes dans<em> Candida</em> espèces

Les espèces de Candida sont des champignons commensaux qui colonisent le tractus intestinal et génito de tous les humains. Dans des conditions d'immunodéficience, telles que celle se produisent avec une naissance prématurée ou d' effets immunosuppresseurs de traitements pour le cancer, les espèces de Candida peuvent devenir pathogènes opportunistes. Parmi les espèces de Candida, Candida albicans est le colonisateur fongique la plus répandue et provoque la majorité des infections fongiques invasives. D' autres espèces de Candida telles que C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis et C. kruseii aussi causer des infections graves chez les patients immunodéprimés, avec une certaine résistance intrinsèque présentant aux antibiotiques couramment utilisés anti-fongiques comme le fluconazole et l' amphotéricine B. Par conséquent, infections avec certaines de ces espèces sont observées plus fréquemment, en particulier chez les patients traités à titre prophylactique avec des agents anti-fongiques. Même avec un approprié et opportuntraitement nti-fongiques, les infections à Candida invasives continuent d'être associée à ^une morbidité et une mortalité significatives. En raison de l'importance des espèces de Candida dans la santé humaine, il y a un besoin d'outils moléculaires facilement disponibles qui permettent l'étude et l' élucidation de leurs mécanismes de pathogénicité.

Un outil important qui permet aux chercheurs de visualiser et de quantifier les cellules microbiennes et les protéines qu'ils expriment est la technologie de fusion FP. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) de modification de gène médiée, tel que décrit dans le présent document, permet la construction de fusions, entre les séquences de PF et une séquence codante d'intérêt à son locus génomique protéine Candida. Une intégration stable de la construction facilite l'analyse de l'expression des protéines ainsi que la dynamique des protéines de localisation. Les plasmides contenant des séquences de PF, optimisés pour l' expression dans Candida albicans et que peuvent être utilisés dans la g médiée par PCRstratégie de modification ène ont été préalablement construits ^{2, 3, 4, 5.} Plasmides contiennent PF transformation «cassettes»: une séquence de FP lié à un gène marqueur nutritionnel qui favorise la transformation de C. albicans et C. parapsilosis ^{2, 3, 4, 5, 6, 7.} À l' heure actuelle plasmides disponibles contiennent une variété de gènes sélectionnables marqueurs nutritionnels (URA3 His1, ARG4) pour la transformation des souches auxotrophes, ainsi qu'un marqueur de résistance aux médicaments dominante (NAT1), ce qui facilite la transformation des souches cliniques dépourvues auxotrophies. En outre, des plasmides contiennent des options pour jusqu'à quatre séquences différentes de PF (vert [GFP], yellow [YFP], cyan [PCP] et de cerise [mCherry]) et soit une séquence de terminaison ADH1 pour la construction d' un carboxy-terminale des protéines de fusion, ou une séquence de promoteur pour la construction d'amino-terminale des protéines de fusion. Les amorces sont conçues avec une homologie avec l'ADN du plasmide entourant la cassette FP. En outre, les amorces contiennent également des séquences 5 ' d' extension portant une homologie avec le gène de levure d'intérêt à marquer, ce qui facilite l' intégration de la cassette dans le locus génomique par recombinaison homologue (figure 1). Spécifique du gène FP cassettes sont générés par PCR et ensuite transformés en cellules de Candida rendues compétentes pour l' absorption de l' ADN par un traitement avec de l' acétate de lithium.

Figure 1: Schéma de la façon dont les fusions de séquences PF sont générées dans les espèces de Candida. (A) L' ADN de plasmide includes une séquence de PF et une séquence codant pour la résistance nourseothricine (NAT1). emplacements relatifs de l'avant (FWD) et inverse (REV) les amorces sont représentées, avec des parties noires des amorces indiquant la région d'homologie à la séquence plasmidique et les portions violet dénotant la région d'homologie spécifique d'un gène ou d'une extension d'amorce. Cassettes (B) PF sont transformées en Candida et à intégrer au sein du locus génomique de ENO1 par recombinaison homologue (lignes en pointillés). (C) résultant séquence de fusion FP à l'extrémité 3 du ENO1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Ici, nous présentons un exemple de la protéine de fusion (ENO1-FP) constructions dans les espèces de Candida. Nous utilisons le marquage des plasmides contenant le gène marqueur de transformation NAT1 avec des séquences codant pour la GFP, YFP, oumCherry (figure 2). Ces plasmides sont utilisés conjointement avec des amorces de PCR pour générer des cassettes spécifiques de gènes qui facilitent la fusion de PCR à l'extrémité 3 'de ENO1, ayant pour résultat l' expression de ENO1 fusionnée à son extrémité carboxy à MF-terminale.

Figure 2: Carte de PF plasmides contenant la cassette. Vers l'avant (F) et arrière (R) des amorces utilisées pour générer les cassettes à partir des plasmides sont indiqués ainsi que la position relative de leur homologie avec les plasmides. Les séquences des amorces sont énumérées dans le tableau 1. F1 et R1 ont également été utilisés pour générer la cassette pYFP- NAT1. Le plasmide contenant la cassette YFP- NAT1 (pMG2263) est identique à pMG2120 à l'exception de la YFP à la place de la séquence de la GFP. Tailles de cassettes: GFP-Nat1, 3,7 kbp; mCherry- NAT1, 3,2 kbp; YFP- NAT1, 3.7 kpb. Ce chiffre a été modifié depuis Gerami-Nejad, et al. ⁴ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.