Die Erzeugung von Fluorescent Protein Fusions in<em> Candida</em> Arten

Candida – Spezies sind symbiotischer Pilze , die die Darm- und Urogenitaltrakts aller Menschen besiedeln. Unter den Bedingungen der Immunschwäche, wie das mit Frühgeburt auftreten oder immunsuppressive Wirkung von Behandlungen für Krebs, kann Candida – Spezies opportunistischen Erregern werden. Von den Candida – Spezies, ist Candida albicans die häufigste Pilz Kolonisator und bewirkt , dass die Mehrheit der invasiven Pilzinfektionen. Andere Candida – Spezies wie C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis und C. kruseii auch schwere Infektionen bei immunsupprimierten Patienten verursachen, mit einigen ausstellenden intrinsische Resistenz gegen häufig Anti-Pilz – Antibiotika wie Fluconazol und Amphotericin B. Daher verwendet, Infektionen mit einigen dieser Arten werden immer häufiger, insbesondere bei Patienten beobachtet prophylaktisch mit Anti-Pilz-Mittel behandelt werden. Auch bei angemessene und rechtzeitige einNTI-Pilz – Behandlung, invasive Candida – Infektionen weiterhin mit einer signifikanten Morbidität und Mortalität ¹ verbunden zu werden. Wegen der Bedeutung von Candida – Spezies in die menschliche Gesundheit besteht ein Bedarf an leicht verfügbaren molekularen Werkzeugen, die die Studie und Aufklärung ihrer Pathogenese – Mechanismen ermöglichen.

Ein wichtiges Instrument, das Forscher ermöglicht die Visualisierung und mikrobiellen Zellen und die Proteine ​​zu quantifizieren, die sie zum Ausdruck bringen ist FP-Fusion-Technologie. Polymerase – Kettenreaktion (PCR) -vermittelte Modifikation Gen, wie in diesem Dokument beschrieben ist , ermöglicht die Konstruktion von Fusionen zwischen FP – Sequenzen und ein Candida Protein von Interesse an seiner genomischen Locus codierende Sequenz. Stabile Integration des Konstrukts erleichtert Analyse der Proteinexpression sowie Proteinlokalisierung Dynamik. Plasmide enthalten FP – Sequenzen, die für die Expression in Candida albicans optimiert und das kann in der PCR-vermittelten g verwendet werdenene Modifikationsstrategie wurden zuvor konstruiert ^{2, 3, 4, 5.} Plasmide enthalten FP transformation "Kassetten": eine Sequenz FP auf einen Ernährungsmarker – Gen verknüpft, die die Transformation von C. albicans und C. parapsilosis ^{2, 3, 4, 5, 6, 7} erleichtert. Derzeit verfügbare Plasmide enthalten eine Vielzahl von selektierbaren Markergenen Nahrungs (URA3, HIS1, ARG4) für die Transformation von auxotrophen Stämmen sowie eine dominant Arzneimittelresistenzmarker (NAT1), die Auxotrophien fehlt Transformation von klinischen Stämmen ermöglicht. Darüber hinaus enthalten die Plasmide Optionen für bis zu vier verschiedenen FP-Sequenzen (grün [GFP], yellow [YFP], cyan [CFP] und Kirsche [mCherry]) und entweder eine ADH1 Terminierungssequenz für den Bau von Carboxy-terminus Protein – Fusionen oder einer Promotorsequenz für den Bau von Amino-Terminus Protein – Fusionen. Primer werden mit Homologie zu der Plasmid-DNA rund um die FP-Kassette entwickelt. Außerdem enthalten die Primer auch 5'-Verlängerungssequenzen eine Homologie zu dem Hefe – Gen von Interesse trägt markiert werden, der Integration der Kassette in den genomischen Locus durch homologe Rekombination (Figur 1) erleichtert. Genspezifischen FP Kassetten werden durch PCR erzeugt und dann umgewandelt in Candida – Zellen kompetent gemacht für die Aufnahme von DNA durch Behandlung mit Lithiumacetat.

Abbildung 1: Diagramm der wie FP – Sequenz – Fusionen in Candida – Spezies erzeugt werden. (A) Plasmid DNA includes eine FP – Sequenz und eine Sequenz , die Nourseothricin Widerstand (NAT1). Relativen Positionen Vorwärts (FWD) und rückwärts (REV) Primer gezeigt sind, mit schwarzen Abschnitte der Primer die Region der Homologie zu dem Plasmid-Sequenz anzeigt, und die purpurrote Bereiche bezeichnet die genspezifischen Region Homologie oder Primerverlängerung. (B) FP – Kassetten werden in Candida umgewandelt und zu integrieren in der ENO1 genomischen Locus durch homologe Rekombination (gestrichelte Linien). (C) Resultierende FP Fusionssequenz am 3' – Ende von ENO1. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Hier stellen wir ein Beispiel für Protein – Fusion (ENO1-FP) Konstruktionen in Candida – Spezies. Wir verwenden Tagging Plasmide , die die NAT1 Transformation Markergen zusammen mit Sequenzen , die für GFP, YFP enthält, odermCherry (Abbildung 2). Diese Plasmide werden zusammen mit den Primern in PCR verwendet , um genspezifische Kassetten erzeugen , die Fusion von FPs an das 3'-Ende ENO1 erleichtern, was zu einer Expression von ENO1 fusioniert an FPs an seinem Carboxy-Terminus.

Abbildung 2: Karten von FP – Kassette enthaltenden Plasmide. Vorwärts (F) und rückwärts (R) Primer verwendet, um die Kassetten aus den Plasmiden zu erzeugen, zusammen mit der relativen Lage ihrer Homologie zu den Plasmiden angegeben. Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. F1 und R1 wurden auch zur Erzeugung der pYFP- NAT1 Kassette verwendet. Das Plasmid , das das YFP- NAT1 Kassette (pMG2263) enthält , ist identisch mit pMG2120 mit Ausnahme von YFP anstelle des GFP – Sequenz. Kassettengrößen: GFP-NAT1, 3,7 kbp; mCherry- NAT1, 3,2 kbp; YFP- NAT1, 3.7 kbp. Diese Zahl wurde von Gerami-Nejad modifiziert, et al. ⁴ Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.