Floresan protein füzyonları üretilmesi<em> Candida</em> Türler

Candida türleri bütün insanların bağırsak ve genitoüriner yolları kolonize ortakçı mantarlardır. Öyle ki erken doğum ya da kanser tedavilerinden immünsupresif etkileri ile ortaya gibi immün yetmezlik koşulları altında, Candida türleri fırsatçı patojenler olabilir. Candida türlerinin, Candida albicans en yaygın mantar kolonize olup invaziv mantar enfeksiyonlarının çoğunluğu neden olur. Böyle C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, ve C. gibi diğer Candida türleri, bazı sergileyen içsel direnç, bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda ciddi enfeksiyonlara neden kruseii yaygın Dolayısıyla böyle flukonazol ve amfoterisin B gibi anti-mantar kullanılan antibiyotiklere bu türlerin bazı enfeksiyonları özellikle de anti-mantar maddeleri ile profilaktik olarak tedavi edilen hastalarda daha sık rastlanmaktadır. Hatta uygun ve zamanında a ilenti-mantar tedavisi, invaziv Candida enfeksiyonları önemli morbidite ve mortalite ¹ ile ilişkili olmaya devam etmektedir. Çünkü İnsan sağlığı Candida türleri önemi, bunların patogenezi düzenekleri ve iyi açıklanması izin hazır moleküler araçlar için bir ihtiyaç vardır.

Araştırmacılar görselleştirmek ve mikrobiyal hücrelerin ve ifade proteinlerin ölçmek için olanak sağlayan bir önemli bir araçtır FP füzyon teknolojisidir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) aracılık ettiği gen modifikasyonu, bu yazıda tarif edildiği gibi AP dizileri ve genomik ilgilenilen sekansını kodlayan bir Candida proteini arasındaki füzyonlar yapımına izin verir. Yapının istikrarlı entegrasyon protein ifade analizinin yanı sıra protein yerelleştirme dinamikleri kolaylaştırır. AP dizilerini içeren plazmidler, Candida albicans içinde ekspresyon için optimize edilmiş ve PCR aracılı g kullanılabilenen modifikasyonu strateji, daha önce ^{2, 3, 4, 5,} inşa edilmiştir. C. albicans, C. ^{parapsilosis, 2, 3, 4, 5, 6, 7} tarafından tutulan bir besin marker genine bağlanmış bir AP sekansı: plazmidler AP dönüşüm "kaset" içerir. Şu anda mevcut plazmidler seçilebilir beslenme oksotrofik suşlarının transformasyonu için marker genleri (URA3, HIS1, ARG4) yanı sıra oksotrofilerinin yoksun klinik suşların dönüşmesini kolaylaştırmaktadır baskın bir ilâç rezistans markeri (NAT1), çeşitli içerir. Buna ek olarak, plazmidler yello dört farklı FP dizilerinin (yeşil [GFP], seçenekler içeriyor[YFP] W, mavi [CFP] ve kiraz [MCherry]) ve karboksi-termini, proteinin füzyonlarının inşa, veya amino-terminal protein füzyonları yapımı için bir promotör sekansı için bir ADH1 sonlandırma dizisi ya da. Primerler, AP kaseti çevreleyen plasmid DNA'sına homoloji ile tasarlanmıştır. Buna ek olarak, primerler ayrıca, homolog rekombinasyon (Şekil 1) aracılığı ile genomik lokusuna kaset tümlemeyi kolaylaştırır etiketlenecek olan maya geninin homoloji taşıyan 5'-uzantısı dizilerini ihtiva etmektedir. Gen spesifik AP kasetleri, PCR ile üretilen ve daha sonra, lityum asetat ile işlenmesi suretiyle DNA alımı için, yetkin hale getirilmiştir Candida hücrelerine transforme edilmiştir.

Şekil 1: FP dizisi füzyonları Candida türlerinin oluşturulur nasıl diyagramı. (A) plazmid DNA dahil olmakes bir AP dizisi ve direnç (NAT1) nourseothricin bir dizi kodlama. İleri (FWD) ve ters (REV) primerleri rölatif konumları plazmid dizisinin homoloji bölgesini gösteren primerler ve gene-özel homoloji bölgesini ya da primer uzaması gösteren mor kısımların siyah bölümleri ile gösterilir. (B) AP kasetleri Candida dönüştü ve homolog rekombinasyon (noktalı çizgiler) üzerinden ENO1 genomik içinde entegre edilmiştir. ENO1 3 'ucunda AP füzyon sekansı Elde edilen (C). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu yazıda, Candida türlerinin protein füzyon (Eno1-FP) yapıların bir örnek sunuyoruz. Biz GFP, YFP kodlayan diziler ile birlikte NAT1 dönüşüm işaretleyici geni içeren plazmidler etiketleme, ya da kullanmakMCherry (Şekil 2). Bu plazmidler, karboksi-terminalinde FPS kaynaşık Eno1 ekspresyonu ile sonuçlanan ENO1 3'-ucuna FP kaynaşmasını kolaylaştırmak gene özel kasetleri oluşturmak için PCR primerler ile birlikte kullanılmıştır.

Şekil 2: FP kaset içeren plazmid Haritalar. İleri (F) ve plazmidlerden kasetleri oluşturmak için kullanılan geri (R) primerleri plazmidler kendi homoloji göreli konumu ile birlikte gösterilir. Tablo 1 'de gösterildiği gibi olan primer sekanslarıdır. F1 ve R1 de pYFP- NAT1 kasetini oluşturmak için kullanıldı. YFP- NAT1 kaseti (pMG2263) içeren plazmid, GFP dizisinin yerine YFP dışında pMG2120 aynıdır. Kaset boyutları: GFP-NAT1, 3.7 kbp; mCherry- NAT1, 3.2 kbp'lik; YFP- NAT1, 3.7 kbp. Bu rakam, Gerami-Nejad, ve ark modifiye edilmiştir. ⁴ Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.