Summary

Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon

Published: April 26, 2017
doi:

Summary

Burada, Zebra balığı seks farklılaşması ve bakım soruşturmaları kolaylaştıracaktır larva zebrabalıkları, gonadal doku izole etmek için bir protokol mevcut.

Abstract

vahşi Zebra balığı ZZ / ZW cinsiyet belirleme sistemine sahip olmasına rağmen, evcil Zebra balığı seks kromozomuna kaybetti. Bunlar genom topluca bireysel balık seks kimliklerini belirlemek boyunca çeşitli genler dağıtılan polıgenık eşey tayini sistemi kullanmaktadır. Şu anda, genler gonad gelişimini düzenleyen katılır ve nasıl çalışır zor kalır. Normal olarak, gonadal doku izole seks gelişim süreçleri incelemek için ilk adımdır. Burada, zebra balığı dpf larvaları 17 dpf (gün sonra döllenme) ve 25 ile gonadal doku izole etmek için bir prosedürdür. İzole gonadal doku daha sonra morfoloji ve gen ekspresyon profili ile incelenebilir.

Introduction

Vahşi Zebra balığı kromozomu 4'te önemli kadın seks belirleyici 1 (yani ortak laboratuar suşları) kaybolması veya evcil zebrabalıkları değiştirilir. Bunun yerine, sıcaklık, hipoksi, gıda temini ve nüfus yoğunluğu gibi çevresel faktörlerin eşliğinde polıgenık eşey tayini sistemi var. zebra balığı seks gelişme ayrıntılı mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Birincil cinsiyet tespiti sinyal (ler) i / ne tür zebra balığı cinsiyet tespiti oluştuğunda gibi temel soru vardır ve genler gonad dönüşümün ilk adım, 3 2 cevaplanması gereken kalır düzenleyen.

Zebra balığı seks gelişim sürecinde, birçok önemli aşamalar kabul edilmiştir. gelişiminin erken safhasında, 4 HPF (saat sonra döllenme) primordiyal üreme hücreleri (PGC) özellikleri tabi başlanarak genital s göç veçoğalma. PGC sayıları ve germ hücreleri ve somatik hücreler arasındaki karşılıklı etkileşimler gonad farklılaşma 4 için çok önemlidir. 13 dpf (gün sonra döllenme) 'de, gonadlar farklılaşmamış aşamasındadır. 17 dpf'e olarak, gonadlar gelecek hem kadın hem erkeklerin de iki potansiyel yumurtalıkların içine gelişir. yumurtalık apoptozise bağımlı bir geçiş testise 21 ila 25 dpf başlar ve birçok hafta boyunca devam edebilir. 35 dpf ile, gonadal cinsiyet tespit edilmiştir ve cinsiyete spesifik gamet üretimi, 7 her iki yumurtalıkta devam etmektedir ve 6, 5 testisler.

Bugüne kadar, çeşitli aday genleri ve cinsiyet tespiti mekanizmaları önerilmiştir. Proteomik ve transkriptomik analizi, dimorfik ifade bulunan pek çok gen izole ettik ve bu genler zebrabalıkları 8 seks farklılaşma çalışma kullanılmıştır </sup> 9, 10. Örneğin, larva zebrabalıkları, cyp19a1a gen özel olarak fakat testis 11, 12 yumurtalık olarak ifade edilir. Buna ek olarak, AMH geni zayıf yumurtalık folikül granüloza hücrelerinde eksprese edilir, ancak güçlü bir testis Sertoli hücreleri 13 edilmektedir. Bunun aksine, vasa geni sürekli olarak uygun bir gonad işaretleyici 14, 15 yaparak, dişi ve erkek zebrabalıkları germ hücrelerinde ifade edilir.

Gonadal gen ekspresyon düzeyleri incelenmesi, özellikle iki potansiyel yumurtalık aşama 3, 9, cinsiyet tespiti ve diferansiyasyonuna ait moleküler mekanizmanın anlaşılması önemlidir. Bununla birlikte, larva zebrabalıkları ve mukabil ölçüde küçük gonad küçük boyutu gonada izolasyonunu karmaşıkDaha fazla moleküler analiz l dokusu. Kullanılan önceki çalışmalar opercula ve anal gözenek 16 arasındaki bütün gövde bölgesini disseke. Bu preparat içeren gonadlar, ancak birden fazla doku ve organların oluşur. Seçenek olarak ise, bu tür vas olarak gonad-spesifik GFP ekspresyonu ile transgenik hayvanları: EGFP flüoresan aktif hücre ayrıştırma (FACS) ve lazer yakalama mikro diseksiyon 17, 18 üzerinden gonadal doku izolasyonu için kullanılmıştır. Ama onların yaygın uygulama sınırlıdır. Burada, 17 dpf ve 25 dpf'e larva zebrafish gonadal doku izole etmek için basit bir prosedür açıklanmaktadır. Diğer organlarda göre gonad konumunu göstermekte ve çevre dokulardan morfolojik olarak bozulmamış gonadlar izole eder. Biz daha yüksek kantitatif PCR ile gövde dokusu (karşılaştırıldığında izole gonadlar olarak ifade edilmiştir, örneğin vaz ve cyp19a1a olarak gonad-spesifik genleri göstermektedirqPCR) analizi. Bu protokol, böylece gonad doku 19 daha sonra moleküler analiz sağlayarak, tanımlanmasını, izolasyonunu RNA saflaştırma ve larva zebrafish gonadal spesifik genlerin amplifikasyonuna olanak tanır.

Protocol

Zebra balığı deneyler Fudan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Balığı, standart prosedürlere 20'ye göre yükseltilmiş ve yetiştirildi. 1. hazırlıklar larva zebrabalıkları dpf 17 dpf ve 25 yetiştirmek geçiş gününden önce geç öğleden sonra bir geçiş tankına Transferi 2 erkek ve 2 dişi yetişkin zebra balığı (sağlıklı, eski 3 ila 6 ay, laboratuvar AB strain). Bir bari…

Representative Results

Gonadların Diseksiyonlar AB strain larva zebrabalıkları uygulandı. Şekil 1, 17 dpf ve 25 dpf larva zebrabalıkları tipik gonadal doku gösterir. Birincisi, deri ve karın bir tarafında kaslarının iç organları açığa çıkarmak için kesilir. iç organların kütlesi çıkardıktan sonra, birlikte gonad ile yüzme kesesi gövde kalır. Yumurtalık ( 'Şekil 1 B' de ok) kesesi ventral tarafın…

Discussion

Zebra balığı güçlü bir model haline gelmiştir ve yoğun gelişme ve hastalıkla ilgili araştırmalarda kullanılır. Örneğin beyin, kalp, gonad ve böbrek gibi yetişkin zebrabalıkları organların izole edilmesi için yöntemler, iyi 23, 24, 25 belgelenmiştir. Nedeniyle küçük boyutu ve larva zebrabalıkları gonadal dokuların dinamik yeniden yapılanmasına bağlı gonadal dokuların izolasyonu zor bir iştir. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz balık bakımı için C Zhang teşekkür ederim. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilim Vakfı (GP için 31.171.074, 31.371.099 ve 31.571.067) tarafından ve Pujiang Talent Projesi (GP için 09PJ1401900) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Cell culture dish 100 mm Corning 430167 For embryo incubation
20 X EM For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O.
1 X EM Dilute 20 X EM in distilled water
AGAROSE G-10 Gene 121985 For preparing the 2% agar plates 
Trizol Reagent Invitrogen 15596-026 For RNA isolation 
Meter glass Shen Bo 250 ml For preparing the 2% agar plates 
Microwave Oven Midea M1-211A For heating the AGAR
TWEEZER DUMONT#5INOX World Precision Instrument 500341 For dissection
Stereomicroscope Motic SMZ168 For dissection
Pure water equipment Millipore
Ringer’s solution For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container.
Transfer pipette Samco 202, 204
Metal bath QiLinbeier Model GL-150
Microscope Leica  M205 FA For photomicrograph
Centrifuge Eppendorf 5417R
Micro Scale RNA Isolation Kit  Ambion AM1931 For RNA isolation from gonad tissues
Dnase I  Sigma AMPD1-1KT For DNA digestion in the RNA solution 
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific #K1631 For  first-strand cDNA synthesis
Rnase H  Thermo Scientific #EN0202 For digesting the residual RNA in the cDNA solution.
SYBR Green Realtime PCR Master Mix TOYOBO QPK-201 This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and  applicable for intercalation assay with SYBR Green I.
Spectrophotometer Ne Drop OD-2000+ Measuring the concentration of the total RNA
Mastercycler Eppendorf AG 22331 Hamburg gene expression profiling

References

  1. Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
  2. Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
  3. Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish. Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).
  4. Blaser, H., et al. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
  5. Wang, X. G., Orban, L. Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).
  6. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  7. Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish. J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).
  8. Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics. Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).
  9. Siegfried, K. R. In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation. J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).
  10. Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome. BMC Genomics. 10, 579 (2009).
  11. Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain. Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).
  12. Kishida, M., Callard, G. V. Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development. Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).
  13. Rodríguez-Marí, A., et al. Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development. Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).
  14. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish. Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).
  15. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development. Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).
  16. Tzung, K. W., et al. Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation. Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).
  17. Hsiao, C., Tsai, H. Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).
  18. Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish. Reprod Biol Endocrinol. 7, 97 (2009).
  19. Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation. Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).
  20. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  21. Liew, W. C., et al. Polygenic sex determination system in zebrafish. PLoS One. 7 (4), e34397 (2012).
  22. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  23. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis Exp. (37), (2010).
  24. Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis Exp. (94), (2014).
  25. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis Exp. (54), (2011).
  26. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).
  27. Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. Germ line development in fishes. Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).
  28. Huang, H. Y., Ketting, R. F. Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation. Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).

Play Video

Cite This Article
Wang, X., Chen, S., Zhang, W., Ren, Y., Zhang, Q., Peng, G. Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue. J. Vis. Exp. (122), e55294, doi:10.3791/55294 (2017).

View Video