Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon
Summary
Burada, Zebra balığı seks farklılaşması ve bakım soruşturmaları kolaylaştıracaktır larva zebrabalıkları, gonadal doku izole etmek için bir protokol mevcut.
Abstract
vahşi Zebra balığı ZZ / ZW cinsiyet belirleme sistemine sahip olmasına rağmen, evcil Zebra balığı seks kromozomuna kaybetti. Bunlar genom topluca bireysel balık seks kimliklerini belirlemek boyunca çeşitli genler dağıtılan polıgenık eşey tayini sistemi kullanmaktadır. Şu anda, genler gonad gelişimini düzenleyen katılır ve nasıl çalışır zor kalır. Normal olarak, gonadal doku izole seks gelişim süreçleri incelemek için ilk adımdır. Burada, zebra balığı dpf larvaları 17 dpf (gün sonra döllenme) ve 25 ile gonadal doku izole etmek için bir prosedürdür. İzole gonadal doku daha sonra morfoloji ve gen ekspresyon profili ile incelenebilir.
Introduction
Vahşi Zebra balığı kromozomu 4'te önemli kadın seks belirleyici 1 (yani ortak laboratuar suşları) kaybolması veya evcil zebrabalıkları değiştirilir. Bunun yerine, sıcaklık, hipoksi, gıda temini ve nüfus yoğunluğu gibi çevresel faktörlerin eşliğinde polıgenık eşey tayini sistemi var. zebra balığı seks gelişme ayrıntılı mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Birincil cinsiyet tespiti sinyal (ler) i / ne tür zebra balığı cinsiyet tespiti oluştuğunda gibi temel soru vardır ve genler gonad dönüşümün ilk adım, 3 2 cevaplanması gereken kalır düzenleyen.
Zebra balığı seks gelişim sürecinde, birçok önemli aşamalar kabul edilmiştir. gelişiminin erken safhasında, 4 HPF (saat sonra döllenme) primordiyal üreme hücreleri (PGC) özellikleri tabi başlanarak genital s göç veçoğalma. PGC sayıları ve germ hücreleri ve somatik hücreler arasındaki karşılıklı etkileşimler gonad farklılaşma 4 için çok önemlidir. 13 dpf (gün sonra döllenme) 'de, gonadlar farklılaşmamış aşamasındadır. 17 dpf'e olarak, gonadlar gelecek hem kadın hem erkeklerin de iki potansiyel yumurtalıkların içine gelişir. yumurtalık apoptozise bağımlı bir geçiş testise 21 ila 25 dpf başlar ve birçok hafta boyunca devam edebilir. 35 dpf ile, gonadal cinsiyet tespit edilmiştir ve cinsiyete spesifik gamet üretimi, 7 her iki yumurtalıkta devam etmektedir ve 6, 5 testisler.
Bugüne kadar, çeşitli aday genleri ve cinsiyet tespiti mekanizmaları önerilmiştir. Proteomik ve transkriptomik analizi, dimorfik ifade bulunan pek çok gen izole ettik ve bu genler zebrabalıkları 8 seks farklılaşma çalışma kullanılmıştır </sup> 9, 10. Örneğin, larva zebrabalıkları, cyp19a1a gen özel olarak fakat testis 11, 12 yumurtalık olarak ifade edilir. Buna ek olarak, AMH geni zayıf yumurtalık folikül granüloza hücrelerinde eksprese edilir, ancak güçlü bir testis Sertoli hücreleri 13 edilmektedir. Bunun aksine, vasa geni sürekli olarak uygun bir gonad işaretleyici 14, 15 yaparak, dişi ve erkek zebrabalıkları germ hücrelerinde ifade edilir.
Gonadal gen ekspresyon düzeyleri incelenmesi, özellikle iki potansiyel yumurtalık aşama 3, 9, cinsiyet tespiti ve diferansiyasyonuna ait moleküler mekanizmanın anlaşılması önemlidir. Bununla birlikte, larva zebrabalıkları ve mukabil ölçüde küçük gonad küçük boyutu gonada izolasyonunu karmaşıkDaha fazla moleküler analiz l dokusu. Kullanılan önceki çalışmalar opercula ve anal gözenek 16 arasındaki bütün gövde bölgesini disseke. Bu preparat içeren gonadlar, ancak birden fazla doku ve organların oluşur. Seçenek olarak ise, bu tür vas olarak gonad-spesifik GFP ekspresyonu ile transgenik hayvanları: EGFP flüoresan aktif hücre ayrıştırma (FACS) ve lazer yakalama mikro diseksiyon 17, 18 üzerinden gonadal doku izolasyonu için kullanılmıştır. Ama onların yaygın uygulama sınırlıdır. Burada, 17 dpf ve 25 dpf'e larva zebrafish gonadal doku izole etmek için basit bir prosedür açıklanmaktadır. Diğer organlarda göre gonad konumunu göstermekte ve çevre dokulardan morfolojik olarak bozulmamış gonadlar izole eder. Biz daha yüksek kantitatif PCR ile gövde dokusu (karşılaştırıldığında izole gonadlar olarak ifade edilmiştir, örneğin vaz ve cyp19a1a olarak gonad-spesifik genleri göstermektedirqPCR) analizi. Bu protokol, böylece gonad doku 19 daha sonra moleküler analiz sağlayarak, tanımlanmasını, izolasyonunu RNA saflaştırma ve larva zebrafish gonadal spesifik genlerin amplifikasyonuna olanak tanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balığı güçlü bir model haline gelmiştir ve yoğun gelişme ve hastalıkla ilgili araştırmalarda kullanılır. Örneğin beyin, kalp, gonad ve böbrek gibi yetişkin zebrabalıkları organların izole edilmesi için yöntemler, iyi 23, 24, 25 belgelenmiştir. Nedeniyle küçük boyutu ve larva zebrabalıkları gonadal dokuların dinamik yeniden yapılanmasına bağlı gonadal dokuların izolasyonu zor bir iştir. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz balık bakımı için C Zhang teşekkür ederim. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilim Vakfı (GP için 31.171.074, 31.371.099 ve 31.571.067) tarafından ve Pujiang Talent Projesi (GP için 09PJ1401900) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Cell culture dish 100 mm | Corning | 430167 | For embryo incubation |
| 20 X EM | For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O. | ||
| 1 X EM | Dilute 20 X EM in distilled water | ||
| AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | For preparing the 2% agar plates |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | For RNA isolation |
| Meter glass | Shen Bo | 250 ml | For preparing the 2% agar plates |
| Microwave Oven | Midea | M1-211A | For heating the AGAR |
| TWEEZER DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | For dissection |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ168 | For dissection |
| Pure water equipment | Millipore | ||
| Ringer’s solution | For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container. | ||
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Metal bath | QiLinbeier | Model GL-150 | |
| Microscope | Leica | M205 FA | For photomicrograph |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micro Scale RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | For RNA isolation from gonad tissues |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | For DNA digestion in the RNA solution |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | #K1631 | For first-strand cDNA synthesis |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | For digesting the residual RNA in the cDNA solution. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and applicable for intercalation assay with SYBR Green I. |
| Spectrophotometer | Ne Drop | OD-2000+ | Measuring the concentration of the total RNA |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | gene expression profiling |
References
- Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
- Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
- Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish. Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).
- Blaser, H., et al. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
- Wang, X. G., Orban, L. Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).
- Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
- Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish. J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).
- Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics. Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).
- Siegfried, K. R. In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation. J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).
- Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome. BMC Genomics. 10, 579 (2009).
- Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain. Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).
- Kishida, M., Callard, G. V. Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development. Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).
- Rodríguez-Marí, A., et al. Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development. Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).
- Krovel, A. V., Olsen, L. C. Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish. Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).
- Krovel, A. V., Olsen, L. C. Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development. Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).
- Tzung, K. W., et al. Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation. Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).
- Hsiao, C., Tsai, H. Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).
- Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish. Reprod Biol Endocrinol. 7, 97 (2009).
- Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation. Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Liew, W. C., et al. Polygenic sex determination system in zebrafish. PLoS One. 7 (4), e34397 (2012).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis Exp. (37), (2010).
- Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis Exp. (94), (2014).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis Exp. (54), (2011).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).
- Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. Germ line development in fishes. Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).
- Huang, H. Y., Ketting, R. F. Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation. Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).
