דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

קובע המין הנשי המרכזי כרומוזום דג זברה פרא 4 אבד או שונה של דג הזברה המבויתת (זני מעבדה הנפוצים כלומר) ^1. במקום זאת, יש להם מערכת קביעת הזוויג polygenic בליווי גורמים סביבתיים כגון טמפרטורה, היפוקסיה, זמינות המזון וצפיפות האוכלוסייה. המנגנונים המפורטים של התפתחות מין דג זברה אינם מובנים במלואם. שאלות יסוד כגון כאשר קביעת הזוויג דג זברה מתרחשת, מה אות קביעת המין העיקרית (ים) היא / הם, ואשר גנים להסדיר את הצעד הראשון של טרנספורמציה שַׁחֲלָה להישאר ייענה ^{2, 3.}

בתהליך פיתוח מין דג זברה, בכמה שלבים חשובים הוכרו. בשלב מוקדם של הפיתוח, החל 4 hpf (הפריה פוסט שעות)-תאי נבט בראשיתי (PGCs) עוברים המפרט, הגירה אל הרכס גניטלישִׂגשׂוּג. מספרים PGC ואינטראקציות גומלין בין תאי הנבט תאים סומטיים חשובים בידול שַׁחֲלָה ^4. בשעה 13 DPF (הפריה פוסט ימים), בלוטות המין נמצאים בשלב מובחן. עד 17 DPF, בלוטות המין להתפתח דו-פוטנציאל שחלות הן נקבות וזכרים בעתיד. המעבר תלוי-אפופטוזיס מן השחלה אל האשכים מתחילים בגיל 21 כדי 25 DPF ועשוי להימשך מספר שבועות. עד 35 DPF, המין של בלוטת המין נקבע וייצור תא מין ספציפי מין מתנהל בשני השחלות ואשכים ^{5, 6, 7.}

נכון להיום, גנים ומנגנוני מועמד מגוונים של קביעת הזוויג הוצעו. פרוטאומיקה וניתוח transcriptomic הצליחו לבודד גנים רבים עם הביטוי דימורפית מינית גנים אלה נוצלו כדי ללמוד בידול מין דג הזברה ^8, </sup> ^{9, 10.} לדוגמה, ב דג הזברה הזחל, הגן cyp19a1a מתבטא במיוחד בשחלה אך לא את האשך ^{11, 12.} בנוסף, גן AMH מתבטא בחולשה בתאי granulosa הזקיק בשחלה, אבל מאוד בתאי testis Sertoli ^13. לעומת זאת, הגן ושה מתבטא באופן רציף בתאי הרבייה של שני דג הזברה הנשית והגברית, מה שהופך אותו סמן שַׁחֲלָה מתאים ^{14, 15.}

חקירת רמות ביטוי הגנים האשכים הוא קריטי כדי להבין את המנגנון המולקולרי של קביעת הזוויג והבחנה במיוחד בשלב הדו-פוטנציאל השחלה ^{3, 9.} עם זאת, גודלו הקטן של דג הזברה הזחל והאשכים קטנים בהתאמה לסבך את הבידוד של gonadal רקמות לניתוח מולקולרי נוסף. מחקרים קודמים השתמשו גזורים באזור תא מטען כולו בין opercula ואת הנקבוביות אנאליות ^16. הכנה זו, למרות בלוטות מין המכיל, מורכבת של רקמות ואיברים מרובים. לחלופין, חיות טרנסגניות עם הביטוי GFP שַׁחֲלָה ספציפיים כגון ושה: EGFP שימשו לבידוד רקמת האשכים באמצעות תא מופעל הקרינה מיון (FACS) ו ללכוד לייזר דיסקציה מיקרו ^{17, 18.} אבל היישום הנרחב שלהם מוגבל. כאן, אנו מתארים תהליך פשוט לבודד רקמת האשכים מן דג הזברה הזחל ב 17 DPF ו 25 DPF. אנחנו מדגימים את המיקום של בלוטות המין ביחס לאיברים אחרים ולבודד את בלוטות המין ללא פגע מורפולוגית הרקמות הסובבות. אנחנו מראים עוד את הגנים ספציפיים שַׁחֲלָה כגון ושה cyp19a1a מבוטאים מאוד בלוטות המין המבודדות לעומת רקמת תא המטען באמצעות PCR כמוני (ניתוח qPCR). הפרוטוקול הנוכחי מאפשר זיהוי, בידוד, טיהור RNA והגברה של גנים ספציפיים אשכים מן דג זברת זחל, ובכך מאפשר ניתוח מולקולרי הבא של רקמת אשכי ^19.