هنا، نقدم بروتوكول لعزل الأنسجة الغدد التناسلية من الزرد اليرقات، التي من شأنها تسهيل التحقيقات في التفرقة بين جنس الزرد والصيانة.
وعلى الرغم من الزرد البرية امتلاك / ZW نظام تحديد الجنس ZZ، فقد الزرد المستأنسة كروموسوم الجنس. وهي تستخدم نظام تحديد الجنس عديدة الجينات، حيث وزعت عدة جينات في جميع أنحاء الجينوم تحدد بشكل جماعي هويات جنس الأسماك الفردية. حاليا، فإن الجينات المسؤولة عن تنظيم تطوير الغدد التناسلية وكيفية عملها يبقى بعيد المنال. عادة، عزل الأنسجة الغدد التناسلية هي الخطوة الأولى لدراسة العمليات التنموية الجنس. هنا، نقدم إجراء لعزل الأنسجة الغدد التناسلية من 17 DPF (أيام آخر الإخصاب) و 25 يرقات DPF الزرد. الأنسجة الغدد التناسلية معزولة ويمكن الاطلاع في وقت لاحق من قبل التشكل والتعبير الجيني التنميط.
يتم فقدان المحدد الإناث رئيسيا في كروموسوم الزرد البرية 4 أو تعديلها في الزرد المستأنسة (أي سلالات مختبر المشتركة) 1. بدلا من ذلك، لديهم نظام تحديد الجنس عديدة الجينات يرافقه العوامل البيئية مثل درجة الحرارة ونقص الأكسجين، وتوافر الغذاء والكثافة السكانية. ليست مفهومة تماما آليات تفصيلية للتنمية الجنس الزرد. أسئلة أساسية مثل عندما يحدث تحديد الجنس الزرد، ما إشارة تحديد الجنس الابتدائية (ق) هو / هي، والجينات التي تنظم الخطوة الأولى من التحول الغدد التناسلية لا يزال يتعين الإجابة 2 و 3.
في عملية التنمية الجنس الزرد، وقد تم الاعتراف عدة مراحل مهمة. في مرحلة مبكرة من التنمية، بدءا من 4 HPF (آخر ساعة الإخصاب) البدائية الجرثومية خلايا (بغتش) الخضوع لمواصفات، والهجرة إلى التلال الأعضاء التناسلية وتكاثر. أرقام PGC والتفاعلات المتبادلة بين الخلايا الجرثومية والخلايا الجسدية مهمة لالغدد التناسلية التمايز 4. في 13 DPF (أيام آخر الإخصاب)، والغدد التناسلية هي في مرحلة غير متمايزة. بنسبة 17 DPF، الغدد التناسلية تتطور إلى المبايض ثنائية محتملة في كل من الإناث والذكور في المستقبل. الانتقال التي تعتمد على الخلايا من المبيض إلى الخصية يبدأ في 21-25 DPF وقد يستمر لعدة أسابيع. بنسبة 35 DPF، وقد تم تحديد جنس الغدد التناسلية وإنتاج الأمشاج مصنفة حسب الجنس جار في كلا المبيضين والخصيتين 5 و 6 و 7.
حتى الآن، وقد اقترحت الجينات وآليات تحديد الجنس مرشح متنوعة. وقد عزل البروتينات وتحليل transcriptomic العديد من الجينات مع التعبير ديمبرافيك جنسيا، وقد استخدمت هذه الجينات لدراسة التمايز بين الجنسين في الزرد 8، </sup> 9 و 10. على سبيل المثال، في الزرد اليرقات، ويتم التعبير عن الجين cyp19a1a تحديدا في المبيض ولكن ليس في الخصية 11 و 12. وبالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن الجينات AMH ضعيفة في خلايا بصيلات المحببة المبيض، ولكن بقوة في الخصية خلايا سيرتولي 13. في المقابل، أعرب الجينات الأوعية مستمر في الخلايا الجرثومية كل من الزرد الإناث والذكور، مما يجعل من الغدد التناسلية علامة مناسبة 14 و 15.
بحثت العلاقة بين مستويات التعبير الجيني الغدد التناسلية أمر بالغ الأهمية لفهم الآلية الجزيئية لتحديد الجنس والتمايز خصوصا في مرحلة المبيض ثنائية إمكانيات 3 و 9. ومع ذلك، فإن صغر حجم الزرد اليرقات والغدد التناسلية صغيرة في المقابل تعقيد عزل gonadaالأنسجة ل لمزيد من التحليل الجزيئي. الدراسات السابقة المستخدمة تشريح منطقة الجذع بأكملها بين الغطاء الخيشومي والمسام الشرج 16. هذا التحضير، على الرغم من أن تحتوي على الغدد التناسلية، ويتكون من الأنسجة والأعضاء متعددة. بدلا من ذلك، والحيوانات المعدلة وراثيا مع التعبير GFP-الغدد التناسلية معين مثل الأوعية: استخدمت EGFP لعزل الأنسجة الغدد التناسلية عن طريق مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) والقبض على الليزر الجزئي تشريح 17 و 18. لكن تطبيقها على نطاق واسع محدودة. هنا، نحن تصف إجراء بسيط لعزل الأنسجة الغدد التناسلية من الزرد اليرقات في 17 DPF و 25 DPF. نحن لشرح موقف الغدد التناسلية فيما يتعلق الأجهزة الأخرى وعزل الغدد التناسلية سليمة شكليا من الأنسجة المحيطة بها. علينا مواصلة تظهر الجينات الغدد التناسلية معين مثل الأوعية وcyp19a1a يتم التعبير عنها بشكل كبير في الغدد التناسلية معزولة مقارنة مع الأنسجة جذع من خلال PCR الكمي (QPCR) التحليل. يسمح هذا البروتوكول تحديد الهوية، والعزلة، وتنقية RNA والتضخيم من جينات معينة الغدد التناسلية من الزرد اليرقات، وبالتالي تمكين التحليل الجزيئي لاحق من أنسجة الغدد التناسلية (19).
أصبح الزرد نموذج قوي ويستخدم على نطاق واسع في مجال التنمية والبحوث المتعلقة بالمرض. وقد الطرق لعزل الأجهزة في الزرد الكبار مثل المخ والقلب والغدد التناسلية، والكلى، وموثقة جيدا 23 و 24 و 25. نظرا لصغر حجم وإعادة الدينا?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر C تشانغ لرعاية الأسماك. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (31171074، 31371099 و31571067 لGP) ومشروع المواهب بوجيانج (09PJ1401900 لGP).
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430167 | For embryo incubation |
20 X EM | For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O. | ||
1 X EM | Dilute 20 X EM in distilled water | ||
AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | For preparing the 2% agar plates |
Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | For RNA isolation |
Meter glass | Shen Bo | 250 ml | For preparing the 2% agar plates |
Microwave Oven | Midea | M1-211A | For heating the AGAR |
TWEEZER DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | For dissection |
Stereomicroscope | Motic | SMZ168 | For dissection |
Pure water equipment | Millipore | ||
Ringer’s solution | For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container. | ||
Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
Metal bath | QiLinbeier | Model GL-150 | |
Microscope | Leica | M205 FA | For photomicrograph |
Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
Micro Scale RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | For RNA isolation from gonad tissues |
Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | For DNA digestion in the RNA solution |
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | #K1631 | For first-strand cDNA synthesis |
Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | For digesting the residual RNA in the cDNA solution. |
SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and applicable for intercalation assay with SYBR Green I. |
Spectrophotometer | Ne Drop | OD-2000+ | Measuring the concentration of the total RNA |
Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | gene expression profiling |