Summary

تشريح اليرقات الزرد الغدد التناسلية الأنسجة

Published: April 26, 2017
doi:

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لعزل الأنسجة الغدد التناسلية من الزرد اليرقات، التي من شأنها تسهيل التحقيقات في التفرقة بين جنس الزرد والصيانة.

Abstract

وعلى الرغم من الزرد البرية امتلاك / ZW نظام تحديد الجنس ZZ، فقد الزرد المستأنسة كروموسوم الجنس. وهي تستخدم نظام تحديد الجنس عديدة الجينات، حيث وزعت عدة جينات في جميع أنحاء الجينوم تحدد بشكل جماعي هويات جنس الأسماك الفردية. حاليا، فإن الجينات المسؤولة عن تنظيم تطوير الغدد التناسلية وكيفية عملها يبقى بعيد المنال. عادة، عزل الأنسجة الغدد التناسلية هي الخطوة الأولى لدراسة العمليات التنموية الجنس. هنا، نقدم إجراء لعزل الأنسجة الغدد التناسلية من 17 DPF (أيام آخر الإخصاب) و 25 يرقات DPF الزرد. الأنسجة الغدد التناسلية معزولة ويمكن الاطلاع في وقت لاحق من قبل التشكل والتعبير الجيني التنميط.

Introduction

يتم فقدان المحدد الإناث رئيسيا في كروموسوم الزرد البرية 4 أو تعديلها في الزرد المستأنسة (أي سلالات مختبر المشتركة) 1. بدلا من ذلك، لديهم نظام تحديد الجنس عديدة الجينات يرافقه العوامل البيئية مثل درجة الحرارة ونقص الأكسجين، وتوافر الغذاء والكثافة السكانية. ليست مفهومة تماما آليات تفصيلية للتنمية الجنس الزرد. أسئلة أساسية مثل عندما يحدث تحديد الجنس الزرد، ما إشارة تحديد الجنس الابتدائية (ق) هو / هي، والجينات التي تنظم الخطوة الأولى من التحول الغدد التناسلية لا يزال يتعين الإجابة 2 و 3.

في عملية التنمية الجنس الزرد، وقد تم الاعتراف عدة مراحل مهمة. في مرحلة مبكرة من التنمية، بدءا من 4 HPF (آخر ساعة الإخصاب) البدائية الجرثومية خلايا (بغتش) الخضوع لمواصفات، والهجرة إلى التلال الأعضاء التناسلية وتكاثر. أرقام PGC والتفاعلات المتبادلة بين الخلايا الجرثومية والخلايا الجسدية مهمة لالغدد التناسلية التمايز 4. في 13 DPF (أيام آخر الإخصاب)، والغدد التناسلية هي في مرحلة غير متمايزة. بنسبة 17 DPF، الغدد التناسلية تتطور إلى المبايض ثنائية محتملة في كل من الإناث والذكور في المستقبل. الانتقال التي تعتمد على الخلايا من المبيض إلى الخصية يبدأ في 21-25 DPF وقد يستمر لعدة أسابيع. بنسبة 35 DPF، وقد تم تحديد جنس الغدد التناسلية وإنتاج الأمشاج مصنفة حسب الجنس جار في كلا المبيضين والخصيتين 5 و 6 و 7.

حتى الآن، وقد اقترحت الجينات وآليات تحديد الجنس مرشح متنوعة. وقد عزل البروتينات وتحليل transcriptomic العديد من الجينات مع التعبير ديمبرافيك جنسيا، وقد استخدمت هذه الجينات لدراسة التمايز بين الجنسين في الزرد </sup> 9 و 10. على سبيل المثال، في الزرد اليرقات، ويتم التعبير عن الجين cyp19a1a تحديدا في المبيض ولكن ليس في الخصية 11 و 12. وبالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن الجينات AMH ضعيفة في خلايا بصيلات المحببة المبيض، ولكن بقوة في الخصية خلايا سيرتولي 13. في المقابل، أعرب الجينات الأوعية مستمر في الخلايا الجرثومية كل من الزرد الإناث والذكور، مما يجعل من الغدد التناسلية علامة مناسبة 14 و 15.

بحثت العلاقة بين مستويات التعبير الجيني الغدد التناسلية أمر بالغ الأهمية لفهم الآلية الجزيئية لتحديد الجنس والتمايز خصوصا في مرحلة المبيض ثنائية إمكانيات 3 و 9. ومع ذلك، فإن صغر حجم الزرد اليرقات والغدد التناسلية صغيرة في المقابل تعقيد عزل gonadaالأنسجة ل لمزيد من التحليل الجزيئي. الدراسات السابقة المستخدمة تشريح منطقة الجذع بأكملها بين الغطاء الخيشومي والمسام الشرج 16. هذا التحضير، على الرغم من أن تحتوي على الغدد التناسلية، ويتكون من الأنسجة والأعضاء متعددة. بدلا من ذلك، والحيوانات المعدلة وراثيا مع التعبير GFP-الغدد التناسلية معين مثل الأوعية: استخدمت EGFP لعزل الأنسجة الغدد التناسلية عن طريق مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) والقبض على الليزر الجزئي تشريح 17 و 18. لكن تطبيقها على نطاق واسع محدودة. هنا، نحن تصف إجراء بسيط لعزل الأنسجة الغدد التناسلية من الزرد اليرقات في 17 DPF و 25 DPF. نحن لشرح موقف الغدد التناسلية فيما يتعلق الأجهزة الأخرى وعزل الغدد التناسلية سليمة شكليا من الأنسجة المحيطة بها. علينا مواصلة تظهر الجينات الغدد التناسلية معين مثل الأوعية وcyp19a1a يتم التعبير عنها بشكل كبير في الغدد التناسلية معزولة مقارنة مع الأنسجة جذع من خلال PCR الكمي (QPCR) التحليل. يسمح هذا البروتوكول تحديد الهوية، والعزلة، وتنقية RNA والتضخيم من جينات معينة الغدد التناسلية من الزرد اليرقات، وبالتالي تمكين التحليل الجزيئي لاحق من أنسجة الغدد التناسلية (19).

Protocol

تمت الموافقة على التجارب الزرد من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة فودان. وأثيرت الزرد ولدت وفقا للاجراءات المتبعة 20. 1. الاستعدادات زراعة 17 DPF و 25 DPF الزر…

Representative Results

تم إجراء تشريح الغدد التناسلية على أب سترين الزرد اليرقات. ويبين الشكل 1 أنسجة الغدد التناسلية نموذجية من الزرد اليرقات في 17 DPF و 25 DPF. أولا، يتم قطع الجلد والعضلات من جانب واحد من البطن لكشف الأعضاء الداخلية. بعد إزالة كتلة من الأعضاء …

Discussion

أصبح الزرد نموذج قوي ويستخدم على نطاق واسع في مجال التنمية والبحوث المتعلقة بالمرض. وقد الطرق لعزل الأجهزة في الزرد الكبار مثل المخ والقلب والغدد التناسلية، والكلى، وموثقة جيدا 23 و 24 و 25. نظرا لصغر حجم وإعادة الدينا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر C تشانغ لرعاية الأسماك. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (31171074، 31371099 و31571067 لGP) ومشروع المواهب بوجيانج (09PJ1401900 لGP).

Materials

Cell culture dish 100 mm Corning 430167 For embryo incubation
20 X EM For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O.
1 X EM Dilute 20 X EM in distilled water
AGAROSE G-10 Gene 121985 For preparing the 2% agar plates 
Trizol Reagent Invitrogen 15596-026 For RNA isolation 
Meter glass Shen Bo 250 ml For preparing the 2% agar plates 
Microwave Oven Midea M1-211A For heating the AGAR
TWEEZER DUMONT#5INOX World Precision Instrument 500341 For dissection
Stereomicroscope Motic SMZ168 For dissection
Pure water equipment Millipore
Ringer’s solution For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container.
Transfer pipette Samco 202, 204
Metal bath QiLinbeier Model GL-150
Microscope Leica  M205 FA For photomicrograph
Centrifuge Eppendorf 5417R
Micro Scale RNA Isolation Kit  Ambion AM1931 For RNA isolation from gonad tissues
Dnase I  Sigma AMPD1-1KT For DNA digestion in the RNA solution 
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific #K1631 For  first-strand cDNA synthesis
Rnase H  Thermo Scientific #EN0202 For digesting the residual RNA in the cDNA solution.
SYBR Green Realtime PCR Master Mix TOYOBO QPK-201 This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and  applicable for intercalation assay with SYBR Green I.
Spectrophotometer Ne Drop OD-2000+ Measuring the concentration of the total RNA
Mastercycler Eppendorf AG 22331 Hamburg gene expression profiling

References

  1. Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
  2. Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
  3. Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish. Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).
  4. Blaser, H., et al. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
  5. Wang, X. G., Orban, L. Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).
  6. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  7. Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish. J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).
  8. Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics. Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).
  9. Siegfried, K. R. In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation. J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).
  10. Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome. BMC Genomics. 10, 579 (2009).
  11. Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain. Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).
  12. Kishida, M., Callard, G. V. Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development. Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).
  13. Rodríguez-Marí, A., et al. Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development. Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).
  14. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish. Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).
  15. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development. Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).
  16. Tzung, K. W., et al. Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation. Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).
  17. Hsiao, C., Tsai, H. Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).
  18. Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish. Reprod Biol Endocrinol. 7, 97 (2009).
  19. Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation. Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).
  20. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  21. Liew, W. C., et al. Polygenic sex determination system in zebrafish. PLoS One. 7 (4), e34397 (2012).
  22. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  23. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis Exp. (37), (2010).
  24. Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis Exp. (94), (2014).
  25. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis Exp. (54), (2011).
  26. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).
  27. Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. Germ line development in fishes. Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).
  28. Huang, H. Y., Ketting, R. F. Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation. Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).

Play Video

Cite This Article
Wang, X., Chen, S., Zhang, W., Ren, Y., Zhang, Q., Peng, G. Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue. J. Vis. Exp. (122), e55294, doi:10.3791/55294 (2017).

View Video