Dissectie van larvale zebravis Gonadale Tissue

De belangrijkste vrouwelijke geslacht determinant in het wild levende zebravis chromosoom 4 is verloren of gewijzigd in de gedomesticeerde zebravis (dwz gemeenschappelijke lab stammen) ^1. In plaats daarvan hebben ze een polygene geslachtsbepaling systeem vergezeld door omgevingsfactoren zoals temperatuur, hypoxie, voedselbeschikbaarheid en bevolkingsdichtheid. De gedetailleerde mechanismen van de zebravis sex ontwikkeling worden niet volledig begrepen. Fundamentele vragen zoals wanneer zebravis geslachtsbepaling optreedt, wat de primaire geslachtsbepaling signaal (s) is / zijn, en welke genen reguleren de eerste stap van gonade omzetting nog worden beantwoord ^{2, 3.}

In het proces van zebravis seks ontwikkeling, hebben een aantal belangrijke stadia erkend. In de vroege fase van ontwikkeling, uitgaande van 4 HPF (uur na bevruchting) primordiale kiemcellen (PGC) ondergaan specificatie, migratie en genitale ridgeproliferatie. PGC aantallen en onderlinge interacties tussen kiemcellen en somatische cellen zijn belangrijk voor differentiatie ⁴ gonaden. Op 13 dpf (dagen na de bevruchting), de geslachtsklieren zijn in de ongedifferentieerde fase. Uiterlijk op 17 dpf, de geslachtsklieren zich ontwikkelen tot bi-potentieel eierstokken in zowel de toekomstige vrouwen en mannen. De apoptose-afhankelijke overgang van de eierstok naar de testis beginnen bij 21 tot 25 dpf en kunnen gedurende een aantal weken. Met 35 dpf, heeft het geslacht van de gonaden bepaald en geslacht-specifieke productie van gameten gang in beide eierstokken en testes ^{5, 6, 7.}

Tot op heden hebben diverse kandidaat-genen en mechanismen van geslachtsbepaling voorgesteld. Proteoomanalyse en transcriptoom analyse hebben veel genen die seksueel dimorfe expressie en deze genen zijn gebruikt om geslachtsdifferentiatie studie in zebravis ^8, </sup> ^{9, 10.} Bijvoorbeeld, in larvale zebravis, de cyp19a1a gen specifiek tot expressie gebracht in de eierstok maar niet in de testis ^{11, 12.} Bovendien wordt AMH gen zwak tot expressie gebracht in de follikel granulosa cellen, maar sterk testis Sertoli cellen ^13. Daarentegen wordt vasa gen continu tot expressie gebracht in de geslachtscellen van zowel vrouwelijke als mannelijke zebravis, waardoor het een geschikte gonade marker ^{14, 15.}

Onderzoeken gonadale genexpressieniveaus is cruciaal voor het moleculaire mechanisme van de geslachtsbepaling en differentiatie begrijpen name de bi-potentiaal eierstok fase ^{3, 9.} De geringe omvang van larvale zebravis en dienovereenkomstig kleine gonaden compliceren de isolatie van gonadal weefsel voor verdere moleculaire analyse. Eerdere studies gebruikt ontleed gehele heupgebied tussen opercula en anale poriën ^16. Dit preparaat hoewel bevattende geslachtsklieren, bestaat uit meerdere weefsels en organen. Als alternatief kunnen transgene dieren met gonaden-specifiek GFP expressie zoals vasa: EGFP werden voor gonaden weefsel isoleren door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) en laser capture microdissectie ^{17, 18.} Maar hun wijdverbreide toepassing is beperkt. We beschrijven hier een eenvoudige procedure om gonaden weefsel te isoleren van larvale zebravis 17 dpf en 25 dpf. We tonen de positie van de geslachtsklieren met betrekking tot andere organen en isoleer de morfologisch intact geslachtsklieren uit de omliggende weefsels. We de gonaden-specifieke genen zoals vasa en cyp19a1a tonen verder zijn sterk tot expressie gebracht in de geïsoleerde geslachtsklieren opzichte van de romp weefsel door kwantitatieve PCR (qPCR) analyse. Het huidige protocol maakt de identificatie, isolatie, zuivering en RNA-amplificatie van specifieke gonadale genen van larvale zebravis, waardoor verdere moleculaire analyse gonadale weefsel ¹⁹ mogelijk.