Summary

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em> Mycobacterium tuberculosis</em

Published: April 05, 2017
doi:

Summary

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Introduction

Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis (TB), es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. TB-Drogas sensible es una enfermedad tratable que requiere múltiples antibióticos para un período de 6 meses. A pesar de ser una enfermedad tratable, la mortalidad por tuberculosis se estimó en 1,5 millones en 2015 1. En los últimos 10 años, han aumentado las preocupaciones sobre la prevalencia de resistente a los medicamentos M. tuberculosis. Multirresistente TB (MDR-TB) se define como la tuberculosis que es resistente a al menos isoniazida (INH) y la rifampicina (RMP), y la mayoría de las cepas MDR-TB son también resistentes para seleccionar fármacos antituberculosos de segunda línea, lo que limita las opciones de tratamiento . Los efectos de la resistencia a los medicamentos crean un mayor desafío para el tratamiento de pacientes coinfectados con virus de inmunodeficiencia humana (VIH); 400.000 pacientes en todo el mundo murieron de tuberculosis asociada al VIH en 2015 1. Lamentablemente, los Estados Unidos de Alimentos y Medicamentos Administración ha aprobado sólo un nuevo medicamento contra la tuberculosis MDR-TB, bedaquiline, en los últimos 40 años 2. Se necesitan con urgencia los avances en la búsqueda de mejores y más cortas las terapias de TB con el fin de mantenerse a la vanguardia en la lucha contra la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente.

Tradicionalmente, las pantallas de drogas TB se llevan a cabo en condiciones de crecimiento in vitro en medio de crecimiento, con lo que se añaden compuestos a un cultivo en crecimiento y de su eficacia en la erradicación de los microorganismos se determinó por recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en medio sólido. Como recuentos de CFU requieren mucho trabajo, mucho tiempo, y costoso, diversos métodos indirectos se han desarrollado para aliviar este problema. Tales métodos incluyen el ensayo Alamar Blue viabilidad 3, la determinación de la fluorescencia 4 de la proteína verde fluorescente (GFP) o luminiscencia 5 a partir de bacterias de luciferasa que expresan, y la estimación de la adenosina trifosfato total de (ATP) 6, 7.

TB típica se caracteriza por una infección por M. tuberculosis del pulmón, donde las bacterias residen y se replican dentro de las fagosomas de los macrófagos alveolares 8. El simple pantalla fenotípica en caldo puede adaptarse a los patógenos extracelulares; sin embargo, en la perspectiva histórica, golpean compuestos contra M. tuberculosis identificados mediante este método a menudo no logran cumplir con las expectativas durante las etapas de validación aguas abajo en modelos de infección. Proponemos que los medicamentos antituberculosos se realiza mejor en un modelo de infección de la célula huésped intracelular. Sin embargo, los modelos intracelulares poseen muchas barreras tecnológicas y biológicas a screening (HTS) el desarrollo de alto rendimiento. Un gran obstáculo es la complejidad del proceso de infección, ejemplificada por numerosos pasos y el elaborado eliminación de bacterias extracelulares en el medio de lavado. Un segundo obstáculo importante es el largo tiempo de requirements, como la detección de crecimiento, normalmente realizado por CFU contando en placas de cultivo, es un proceso que toma más de 3 semanas en completarse. Una solución para reemplazar los recuentos de CFU ha sido proporcionada por microscopía fluorescente automatizado en combinación con las bacterias fluorescentes. Sin embargo, esta solución requiere una inversión inicial del equipo que está fuera del alcance de muchos laboratorios de investigación. A simple, de bajo costo, y el método HTS-enfermedad pertinente mejoraría en gran medida el proceso de descubrimiento de fármacos.

En este estudio, se presenta un nuevo sistema, HTS modular que está dirigido a proporcionar un rápido y altamente escalable, con todo económica, ensayo adecuado para determinar la actividad de los compuestos contra M. tuberculosis intracelular. Este sistema se compone de tres módulos: (i) intracelular, (ii) la citotoxicidad, y (iii) ensayos in-caldo. El resultado final combinado proporciona una descripción completa de las propiedades del compuesto, con información adicional en cuanto al modo de acción potencial. este SCsistema reening se ha utilizado en varios proyectos con diversas bibliotecas de compuestos que modo de acción objetivo, incluyendo el análisis de la sinergia de drogas 9, la estimulación de la autofagia 10, y la inhibición de M. tuberculosis -secreted factor de virulencia (no publicado). Los compuestos de modo de acción desconocido también se han estudiado 11. Una versión modificada de este método fue también adoptado por nuestro socio industrial como método de cribado primario de identificar nuevos compuestos contra intracelular M. tuberculosis 11.

Protocol

1. cepa bacteriana y el medio de crecimiento Hacer dextrosa albúmina y solución de sal de stock (ADS) por solubilización de 25 g de albúmina de suero bovino, 10,0 g de dextrosa, y 4,05 g de cloruro de sodio en 460 ml de agua desionizada. Filter-esterilizar el ADS y almacenar a 4 ° C. Hacer caldo 7H9 mediante la adición de 4,7 g de 7H9 en polvo y 2 ml de glicerol a 900 ml de agua purificada. Autoclave el caldo 7H9 a 121 ° C durante 10 min y permitir que se enfríe a temperatura ambiente antes …

Representative Results

Detección intracelular de alto rendimiento usando M. tuberculosis que expresa el gen de la luciferasa La figura 2A y en la Tabla 1 contienen los datos brutos recogidos por el luminómetro, expresados en unidades luminiscentes relativas (RLU), que muestra el efecto de una concentración creciente de la rifampicina fármaco TB en M. tuberculosis dentro de las células THP-1. <str…

Discussion

El objetivo de este estudio fue la creación de una forma sencilla y rentable método HTS usando un modelo de infección intracelular humano para M. tuberculosis. La tuberculosis es una enfermedad humana caracterizada por la infección de los macrófagos alveolares por M. tuberculosis. Debido a cuestiones de bioseguridad, la investigación con modelos biológicos, tanto de la bacteria y las células huésped se ha utilizado en el pasado. Sin embargo, se ha demostrado que el uso de bacterias portadoras …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.

Materials

RPMI 1640 Sigma-Aldrich R5886
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12483020
Middlebrook 7H9 Becton, Dickinson and Company 271210
Tween80 Fisher Scientific T164
Albumin, Bovine pH7 Affymetrix 10857
Dextrose Fisher Scientific BP350
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358
kanamycin sulfate Fisher Scientific BP906
PMA Sigma-Aldrich P8139
MTT Sigma-Aldrich M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF) Fisher Scientific D131
1M Hydrocholoric acid (HCl) Fisher Scientific 351279212
Acetic acid Fisher Scientific 351269
SDS Fisher Scientific BP166
Resazurin Alfa Aesar B21187
DMSO Sigma-Aldrich D5879
Glycerol Fisher Scientific BP229
THP-1 American Type Culture Collection TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate Corning 3917
95-well flat bottom clear plate Corning 3595
Transparent plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-0580
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Biomate 3
Microplate spectrophotometer Biotek Epoch
luminometer Applied Biosystems Tropix TR717

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Cite This Article
Zheng, X., Av-Gay, Y. System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (122), e55273, doi:10.3791/55273 (2017).

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