Summary

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em> Mycobacterium tuberculosis</em

Published: April 05, 2017
doi:

Summary

We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Introduction

Mycobacterium tuberculosis, de verwekker van tuberculose (TB), is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Geneesmiddel- gevoelige TB is een behandelbare ziekte die meerdere antibiotica gedurende 6 maanden vereist. Ondanks dat het een behandelbare ziekte, werd TB sterfte geschat op 1,5 miljoen in 2015 1. In de afgelopen 10 jaar zijn er zijn toenemende bezorgdheid over de prevalentie van resistente M. tuberculosis. Multiresistente tuberculose (MDR-TB) wordt gedefinieerd als tuberculose die resistent is tegen ten minste isoniazide (INH) en rifampicine (RMP), en de meeste MDR-TB-stammen zijn ook bestand tegen tweedelijns tbc selecteren, dus beperkt behandelingsmogelijkheden . De effecten van geneesmiddelresistentie maken een grotere uitdaging voor de behandeling van patiënten die geïnfecteerd zijn met humaan immunodeficiëntievirus (HIV); 400.000 patiënten wereldwijd overleden aan HIV-geassocieerde TB in 2015 1. Teleurstellend, de Amerikaanse Food and Drug Administrantsoen heeft goedgekeurd slechts één nieuwe TB-geneesmiddelen tegen MDR-TB, Bedaquiline, in de afgelopen 40 jaar 2. Vooruitgang in het vinden van betere en kortere TB therapieën zijn dringend nodig om voorop te blijven in de strijd tegen tbc en MDR-TB.

Traditioneel worden TB drug screens uitgevoerd onder in vitro kweekomstandigheden in groeimedium, waarbij verbindingen worden toegevoegd aan een groeiende kweek en hun doeltreffendheid bij het uitroeien van de micro-organismen wordt bepaald door het tellen van kolonievormende eenheden (CFU) op vast medium. Zoals CFU tellingen zijn arbeidsintensief, tijdrovend en kostbaar zijn verschillende indirecte methoden ontwikkeld om dit probleem te verlichten. Dergelijke werkwijzen omvatten de Alamar Blue assay levensvatbaarheid 3, de bepaling van fluorescentie 4 van groen fluorescent eiwit (GFP) of luminescentie 5 van luciferase-expressie bacteriën, en de schatting van de totale adenosine trifosfaat (ATP) 6, 7.

Typische TB wordt gekenmerkt door een M. tuberculosis-infectie van de longen, waar de bacteriën bevinden en repliceren in de phagosomes van alveolaire macrofagen 8. De eenvoudige bouillon fenotypische scherm kan extracellulaire pathogenen te passen; Echter, in het historisch perspectief, sloeg verbindingen tegen M. tuberculosis geïdentificeerd met behulp van deze methode vaak niet om te voldoen aan de verwachtingen tijdens downstream validatie stappen in modellen van infectie. Wij stellen voor dat TB drug wordt het best uitgevoerd in een intracellulaire gastheercel infectie model. Toch intracellulaire modellen beschikken over een groot aantal technologische en biologische barrières voor high-throughput screening (HTS) ontwikkeling. Een grote hindernis is de complexiteit van het infectieproces, geïllustreerd door tal van stappen en de uitgebreide verwijdering van extracellulaire bacteriën door middel van in-tussen wassen. Een tweede belangrijke horde is de lange tijd aan het opnieuwquirements, de groei detectie Gewoonlijk wordt hierbij CFU rekenen op kweekplaten, is een proces dat meer dan 3 weken in beslag neemt. Een oplossing voor CFU tellingen vervangen is door geautomatiseerde fluorescentie microscopie in combinatie met fluorescerende bacteriën. Echter, deze oplossing vereist een initiële investering in apparatuur die buiten het bereik van vele onderzoekslaboratoria. Een eenvoudige, goedkope en ziekte-relevante HTS methode zou sterk verbeteren het geneesmiddel ontdekkingsproces.

In deze studie rapporteren we een nieuwe, modulaire HTS systeem dat is gericht op een snelle en zeer schaalbaar, zuinige, assay voor de bepaling van de activiteit van verbindingen tegen intracellulaire M. tuberculosis. Dit systeem bestaat uit drie modules: (i) intracellulair, (ii) cytotoxiciteit en (iii) in bouillon assays. De gecombineerde eindresultaat geeft een uitgebreide beschrijving van de verbinding eigenschappen, aanvullende informatie over de mogelijke werkingsmechanismen. dit screening systeem is gebruikt in verscheidene projecten verschillende samengestelde bibliotheken die werkingsmechanisme targeten, waaronder de analyse van geneesmiddel synergie 9, de stimulering van autofagie 10, en de remming van M. tuberculosis -secreted virulentiefactor (ongepubliceerd). Verbindingen van onbekende werkingsmechanisme hebben ook onderzocht 11. Een aangepaste versie van deze methode werd ook door onze industriële partner aangenomen als de primaire screening methode om nieuwe verbindingen te identificeren tegen intracellulaire M. tuberculosis 11.

Protocol

1. bacteriestam en groeimedium Voeg albumine dextrose en zout voorraadoplossing (ADS) door het oplossen van 25 g runderserumalbumine, 10,0 g dextrose en 4,05 g natriumchloride in 460 ml gedeioniseerd water. Filter-steriliseer de ADS en bewaar bij 4 ° C. Voeg 7H9 bouillon door toevoeging van 4,7 g 7H9 poeder en 2 ml glycerol en 900 ml gezuiverd water. Autoclaaf de 7H9 bouillon bij 121 ° C gedurende 10 minuten en laat het afkoelen tot kamertemperatuur alvorens. Maak 7H9ADST door toevoeging van 100 m…

Representative Results

High-throughput screening met intracellulaire M. tuberculosis die het luciferasegen Figuur 2A en Tabel 1 bevat de ruwe gegevens verzameld door de luminometer, uitgedrukt in relatieve luminescentie-eenheden (RLU), die het effect van een toenemende concentratie van tuberculose geneesmiddel rifampicine op M. tuberculosis in THP-1 cellen. Figuur 2A is een spreidings…

Discussion

Het doel van dit onderzoek was om een eenvoudige en kosteneffectieve HTS methode met behulp van een menselijke intracellulaire infectie model voor M. tuberculosis te creëren. Tuberculose is een menselijke ziekte gekenmerkt door de infectie van alveolaire macrofagen van M. tuberculosis. Als gevolg van bioveiligheid kwesties, heeft het onderzoek met biologische modellen van zowel de bacterie en de gastheercellen zijn gebruikt in het verleden. Er is echter aangetoond dat het gebruik van surrogaat bacteri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.

Materials

RPMI 1640 Sigma-Aldrich R5886
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12483020
Middlebrook 7H9 Becton, Dickinson and Company 271210
Tween80 Fisher Scientific T164
Albumin, Bovine pH7 Affymetrix 10857
Dextrose Fisher Scientific BP350
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358
kanamycin sulfate Fisher Scientific BP906
PMA Sigma-Aldrich P8139
MTT Sigma-Aldrich M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF) Fisher Scientific D131
1M Hydrocholoric acid (HCl) Fisher Scientific 351279212
Acetic acid Fisher Scientific 351269
SDS Fisher Scientific BP166
Resazurin Alfa Aesar B21187
DMSO Sigma-Aldrich D5879
Glycerol Fisher Scientific BP229
THP-1 American Type Culture Collection TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate Corning 3917
95-well flat bottom clear plate Corning 3595
Transparent plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-0580
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Biomate 3
Microplate spectrophotometer Biotek Epoch
luminometer Applied Biosystems Tropix TR717

References

  1. WHO. . Global tuberculosis report 2015. , (2016).
  2. Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
  3. Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
  4. Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
  5. Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
  6. Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
  7. Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
  8. Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
  9. Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
  10. Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
  11. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
  12. . THP-1 (ATCC TIB-202) Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016)
  13. Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
  14. Invitrogen. . AlamarBlue assay. , (2008).
  15. . Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
  16. Riss, T. L., et al. . Cell Viability Assays. , (2004).
  17. Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
  18. Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
  19. Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
  20. Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
  21. Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
  22. Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. . The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 147-159 (2015).
  23. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
  24. Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
  25. Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
  26. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
  27. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
  28. Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).

Play Video

Cite This Article
Zheng, X., Av-Gay, Y. System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (122), e55273, doi:10.3791/55273 (2017).

View Video