細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em>結核菌</em

結核菌 、結核（TB）の原因物質は、世界中の罹患率と死亡率の主要な原因です。薬物感受性TBは、6ヶ月の期間にわたって複数の抗生物質を必要とする治療可能な疾患です。治療可能な疾患であるにもかかわらず、結核死亡率は、2015年¹における150万と推定されました。過去10年間で、薬剤耐性結核の有病率に対する懸念が高まっています。多剤耐性結核（MDR-TB）は、少なくともイソニアジド（INH）、及びリファンピシン（RMP）、最もMDR-TB株は、このように治療の選択肢を制限する、第二のラインTB薬を選択することも耐性があるに耐性のあるTBのように定義されます。薬剤耐性の効果は、患者のヒト免疫不全ウイルス（HIV）で同時感染を治療するために大きな課題を作成します。 40万患者は世界中で2015 ¹でHIV関連結核で死亡しました。残念なことに、米国食品医薬品Administ配給は、過去40年間²に、MDR-TB、bedaquilineに対する唯一の新しい結核治療薬を承認しました。より良いと短いTBの治療法を見つけるの進歩が緊急TBとMDR-TBとの戦いに先に滞在するために必要とされています。

伝統的に、TB薬物スクリーニングは、化合物が成長している培養物に添加し、微生物を根絶におけるそれらの有効性は、固体培地上のコロニー形成単位（CFU）をカウントすることによって決定されることにより、増殖培地中でインビトロ増殖条件下で行われます。 CFU数は労働集約的、時間がかかり、かつ高価であるように、様々な間接的な方法は、この問題を軽減するために開発されています。そのような方法は、アラマーブルー生存率アッセイ^3、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはルシフェラーゼを発現する細菌からの発光⁵からの蛍光⁴の決意、および全アデノシン三リン酸の推定（Aを含みます^{TP）6、7。}

典型的なTBは、細菌は肺胞マクロファージ⁸のファゴソーム内部に存在し、複製肺の結核菌の感染によって特徴付けられます。シンプルな中ブロス表現型の画面は、細胞外病原体に合うこと。しかし、歴史的な観点では、この方法を用いて同定された結核菌に対する化合物は、多くの場合、感染モデルにおける下流の検証ステップの間、期待に応えるに失敗ヒット。私たちは、結核治療薬は、最高の細胞内宿主細胞の感染モデルで実行されていることを提案します。それにも関わらず、細胞内のモデルは、ハイスループットスクリーニング（HTS）の開発に多くの技術および生物学的障壁を保有します。大きなハードルは多くの工程と洗浄の間で-による細胞外細菌の精巧な除去によって例示される、感染プロセスの複雑さです。第二の主要なハードルは、長い時間の再ですquirementsは、通常CFU培養プレート上でカウントすることによって行わ増殖検出として、完了するまでに3週間以上を要するプロセスです。 CFUカウントを交換する1つの解決策は、蛍光細菌との組み合わせで自動化された蛍光顕微鏡によって提供されています。しかし、この解決策は、多くの研究室のための手の届かないところにある初期の設備投資が必要となります。シンプル、低コスト、および疾患関連HTS方法を大幅に創薬プロセスを高めるであろう。

本研究では、細胞内の結核菌に対する化合物の活性を決定するのに適した、迅速、かつ拡張性の高い、まだ経済的、アッセイを提供することを目的とする新しい、モジュラーHTSシステムを報告しています。 （I）細胞内、（ii）の細胞毒性、および（iii）中のブロスアッセイ：このシステムは、三つのモジュールから構成されています。合わせた最終的な結果は、作用の潜在的なモードなどの追加情報と、化合物の特性の包括的な説明を提供します。このSCreeningシステムは、薬物相乗作用⁹の分析、オートファジー¹⁰の刺激、および結核菌 -secreted毒性因子（未発表）の阻害を含む作用機序を標的とする様々な化合物ライブラリー、といくつかのプロジェクトで使用されてきました。アクションの未知のモードの化合物はまた^、11を研究されています。この方法の修正版は、細胞内結核菌 ¹¹に対して新規な化合物を同定するための一次スクリーニング法としての産業パートナーによって採択されました。