Sistema per l'efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em> Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi (TB), è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. TB Drug-sensibile è una malattia curabile che richiede più antibiotici per un periodo di 6 mesi. Pur essendo una malattia curabile, la mortalità TB è stato stimato a 1,5 milioni nel 2015 ^1. Negli ultimi 10 anni, ci sono stati crescenti preoccupazioni sulla prevalenza della farmaco-resistente M. tuberculosis. Multiresistente TB (MDR-TB) è definita come TBC che è resistente ad almeno isoniazide (INH) e rifampicina (RMP), e la maggior parte dei ceppi MDR-TB sono anche resistenti per selezionare farmaci di seconda linea TB, limitando così le opzioni di trattamento . Gli effetti della resistenza ai farmaci creano una sfida maggiore per il trattamento di pazienti co-infettati con il virus dell'immunodeficienza umana (HIV); 400.000 pazienti in tutto il mondo sono morte di tubercolosi associata ad HIV nel 2015 ^1. Purtroppo, gli Stati Uniti Food and Drug Administrazione ha approvato un solo nuovo farmaco contro la TB MDR-TB, bedaquiline, negli ultimi 40 anni ^2. I progressi nella ricerca di una migliore e più brevi terapie TB sono urgentemente necessarie al fine di rimanere in testa nella lotta contro la tubercolosi e la MDR-TB.

Tradizionalmente, TB droga schermi vengono eseguite in vitro in condizioni di crescita in terreno di coltura, per cui i composti vengono aggiunti ad una coltura in crescita e la loro efficacia nel sradicare i microrganismi sono determinati dal conteggio delle unità formanti colonie (CFU) su terreno solido. Come conta CFU sono alta intensità di lavoro, che richiede tempo, e costoso, vari metodi indiretti sono stati sviluppati per alleviare questo problema. Tali metodi includono la vitalità dosaggio Alamar Blue ^3, la determinazione della fluorescenza ⁴ dalla proteina verde fluorescente (GFP) o luminescenza ⁵ dai batteri luciferasi che esprimono, e la stima di adenosina trifosfato totale (ATP) ^{6, 7.}

TB tipica è caratterizzata da un'infezione da M. tuberculosis del polmone, in cui i batteri risiedono e replicano all'interno dei fagosomi di macrofagi alveolari ^8. Lo schermo semplice in brodo fenotipica può soddisfare patogeni extracellulari; tuttavia, in prospettiva storica, ha colpito composti contro M. tuberculosis individuati con questo metodo spesso non riescono a essere all'altezza delle aspettative durante le fasi di validazione a valle in modelli di infezione. Proponiamo che la tubercolosi farmaco è meglio eseguita in un modello di infezione cellula ospite intracellulare. Tuttavia, i modelli intracellulari possiedono molte barriere tecnologiche e biologiche di screening (HTS) sviluppo ad alta produttività. Un grande ostacolo è la complessità del processo di infezione, esemplificato da numerosi passaggi e la rimozione elaborato di batteri extracellulari da in-tra lavaggio. Un secondo ostacolo principale è il tempo lungo rigenze, il rilevamento crescita, normalmente svolto da CFU contando su piastre di coltura, è un processo che richiede più di 3 settimane per completare. Una soluzione per sostituire una conta è stata fornita mediante microscopia a fluorescenza automatizzata in combinazione con i batteri fluorescenti. Tuttavia, questa soluzione richiede un investimento iniziale che apparecchiatura è fuori portata per molti laboratori di ricerca. Un semplice, a basso costo, e il metodo HTS malattie rilevanti sarebbero migliorare notevolmente il processo di scoperta di nuovi farmaci.

In questo studio, riportiamo un nuovo sistema modulare HTS che mira a fornire un rapido e altamente scalabile, ma economica, saggio atto a determinare l'attività dei composti contro M. tuberculosis intracellulare. Questo sistema è composto da tre moduli: (i) intracellulari, (ii) citotossicità, e (iii) Prove in brodo. Il risultato finale combinato fornisce una descrizione completa delle proprietà dei componenti, con ulteriori informazioni riguardanti la modalità potenziale di azione. Questo scSistema reening è stato utilizzato in diversi progetti con varie librerie di composti modalità di azione che colpiscono, compresa l'analisi di sinergia farmaco ^9, la stimolazione dell'autofagia ^10, e l'inibizione di M. tuberculosis -secreted fattore di virulenza (non pubblicata). I composti di modalità sconosciuta di azione sono stati studiati ^11. Una versione modificata di questo metodo è stato adottato anche dal nostro partner industriale come il metodo di screening primario di identificare nuovi composti contro intracellulare M. tuberculosis ^11.