פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק.
Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.
שחפת Mycobacterium, הסוכן סיבתי של שחפת (TB), היא הסיבה המובילה לתחלואה ותמותה בעולם. Drug-רגיש TB היא מחלה שניתן לטפל הדורשת אנטיביוטיקה מרובה לתקופה של 6 חודשים. למרות היותו מחלה שניתן לטפל בה, תמותת TB נאמד ב -1.5 מיליון 2015 1. בשנת 10 השנים האחרונות, התרבו חששות השכיחים של שחפת עמידה לתרופות. Multidrug העמיד TB (MDR-TB) מוגדר TB כי הוא עמיד לפחות איזוניאזיד (INH) ו ריפמפיצין (RMP), ורוב זני MDR-TB הם עמידים גם לבחור סמי TB קו שני, ובכך להגביל את אפשרויות טיפול . ההשפעות של עמידות לתרופות ליצור אתגר גדול לטיפול בחולים במשותף נגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV); 400,000 חולים ברחבי העולם מתו משחפת HIV הקשורים ב 2015 1. למרבה האכזבה, ארצות הברית המזון והתרופות Administיחס אישר תרופה חדשה TB אחד בלבד נגד MDR-TB, bedaquiline, ב 2 40 השנים האחרונות. מקדם במציאת טיפולי TB טובים יותר קצרים יותר יש צורך דחוף כדי להקדים במאבק נגד שחפת MDR-TB.
באופן מסורתי, מסכי סמי TB מבוצעים בתנאי גידול במבחנה במדיום גידול, לפיו תרכובות מתווספות תרבות גוברת והאפקטיביות שלהם בביעור מיקרואורגניזמים נקבעות על ידי ספירת יחידות מושבה להרכיב (CFU) על מדיום מוצק. כמו ספירת CFU הם עבודה אינטנסיבית, גוזל זמן יקר, שיטות עקיפות שונות פותחו כדי להקל על בעיה זו. שיטות אלו כוללות את assay הכדאיות הכחולה Alamar 3, קביעה של קרינה 4 מ חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או הארה 5 מחיידקים להביע בלוציפראז, ואת הערכת אדנוזין אדנוזין הכולל (אTP) 6, 7.
TB האופיינית מאופיינת זיהום שחפת של הריאות, שבו החיידקים מתגוררים ולשכפל בתוך phagosomes של מקרופאגים המכתשית 8. מסך פנוטיפי ב-מרק פשוט עשוי להתאים פתוגנים תאיים; עם זאת, בפרספקטיבה היסטורית, פגע תרכובות נגד שחפת מזוהה בשיטה זו לעיתים קרובות אינם מצליחים לעמוד בציפיות במהלך השלבים אימות במורד הזרם מודלים זיהום. אנו מציעים כי תרופת TB מבוצעת טוב מודל זיהום תא מארח תאי. עם זאת, מודלים תאיים בעלי חסמים טכנולוגיים ביולוגיים רבים לפיתוח הקרנת תפוקה גבוהה (HTS). מכשול גדול הוא המורכבות של תהליך ההדבקה, שהודגם על ידי צעדים רבים וההסרה המשוכללת של חיידקים תאיים על ידי ב-בין הכביסה. משוכה משמעותית שנייה היא מחדש הזמן הממושךquirements, כמו גילוי גידול, בדרך כלל נעשה על ידי CFU לספור על צלחות תרבות, הוא תהליך שלוקח מעל 3 שבועות כדי להשלים. פתרון אחד כדי להחליף ספירת CFU סופק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי בשילוב עם חיידקים פלורסנט. עם זאת, פתרון זה דורש השקעה בציוד ראשונית כי הוא מחוץ להישג ידם של מעבדות מחקר רבות. פשוט, בעלות נמוכה, ושיטת HTS הרלוונטית-מחלה היו מאוד לשפר את תהליך גילוי תרופות.
במחקר זה, אנו מדווחים מערכת HTS חדשה, מודולרי, המכוונת מתן מהיר, ו מדרגית, עדיין חסכוני, assay מתאים לקביעת הפעילות של תרכובות נגד שחפת תאיים. מערכת זו מורכבת משלושה מודולים: (i) תאי, (ii) רעיל לתאים, וכן (iii) מבחנים-מרק. התוצאה הסופית בשילוב מספקת תיאור מקיף של התכונות המתחמות, עם מידע נוסף לגבי מצב פוטנציאלי פעולה. SC זהreening מערכת נעשה שימוש במספר פרויקטים עם ספריות מתחמות שונות למקד במצב של פעולה, כוללים הניתוח של סינרגיה סמי 9, הגירוי של autophagy 10, ואת העיכוב של שחפת -secreted גורם ארסי (לא פורסם). תרכובות של מצב ידוע של פעולה גם נחקרו 11. גרסה שונה של שיטה זו אומצה גם על ידי שיתוף הפעולה עם התעשייה שלנו כשיטת ההקרנה העיקרית לזהות תרכובות חדשות נגד שחפת תאיים מ 11.
מטרת המחקר הנוכחי הייתה ליצור שיטת HTS פשוטה וחסכונית באמצעות מודל זיהום תאיים אדם עבור שחפת. שחפת היא מחלה אנושית מתאפיינת הזיהום של מקרופאגים המכתשית ידי מ שחפת. בשל בעיות בטיחות ביולוגיות, המחקר מעורב מודלים ביולוגיים של שני החיידק ואת תאי המארח נעשה שימו…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by BC Lung Association and Mitacs.
RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
1M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
M. tuberculosis H37Rv | |||
96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |