Visadas<em> In Situ</em> mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

Os quatro proteínas histonas centrais H2A, H2B, H3, H4 e desempenham papéis centrais na compactação, organização e função dos cromossomas eucarióticos. Dois conjuntos de cada uma destas histonas formar o octâmero da histona, um carretel molecular que dirige o invólucro de ~ 147 pares de bases de ADN em torno de si, resultando na formação de um nucleossoma ^1. Nucleossomas são agentes activos numa variedade de processos à base de cromossomas, tais como a regulação da transcrição de genes e a formação de eucromatina e heterocromatina entre cromossomas, e, como tal, têm sido o foco de intensa investigação ao longo de várias décadas passadas. Um número de mecanismos têm sido descritos por nucleossomas que podem ser manipulados em formas que podem facilitar a execução dos processos específicos – estes mecanismos de modificação pós-tradução incluem os resíduos de histonas, remodelar nucleossoma dependente de ATP, e reorganização nucleossoma ATP-independentee montagem / desmontagem ^{2, 3.}

A levedura de germinação Saccharomyces cerevisiae é um organismo particularmente poderoso modelo para a compreensão da função da histona em eucariotas. Isto pode ser em grande parte atribuído ao elevado grau de conservação evolutiva das proteínas histona eukarya todo o domínio e a receptividade de levedura para uma variedade de genética e bioquímica experimental aproxima ^4. abordagens Reverse-genéticos nas leveduras têm sido amplamente utilizada para estudar os efeitos de mutações específicas de histona sobre vários aspectos da biologia da cromatina. Para estes tipos de experiências é frequentemente preferível a utilização de células em que as histonas mutantes são expressos a partir de loci genómico nativo, como a expressão a partir de plasmídeos autónomos podem levar a níveis anormais intracelular de proteínas histona (devido a diferentes números de plasmídeos em células) e alteração concomitante da cromatina enam-, que em última instância pode confundir a interpretação dos resultados.

Aqui, nós descrevemos uma técnica baseada em PCR que permite a mutagénese direccionada de genes de histonas nas suas localizações genómicas nativas, que não requerem um passo de clonagem e resulta na produção da mutação (ões) desejada, sem sequências de ADN exógeno que sobram no genoma. Esta técnica tira proveito do sistema de recombinação homóloga eficiente em levedura e tem várias características em comum com outras técnicas semelhantes desenvolvidas por outros grupos – mais notavelmente o Delitto Perfetto, genômica mutagénese específica (SSG), e alelo à base de PCR clonagem-livre métodos de reposição de ^{5, 6, 7.} No entanto, a técnica que descrevem tem um aspecto que o torna particularmente adequado para a mutagénese de genes de histonas. Em células de levedura haplóides, cada um dos quatro histonas nucleares é codificada por dois não-Agenes llelic e altamente homólogas: por exemplo, histona H3 é codificado pelos genes HHT1 e HHT2, e as grelhas de leitura abertas (ORFs) dos dois genes são mais de 90% idênticos na sequência. Este elevado grau de homologia pode complicar experiências concebidas para visar especificamente um dos dois genes codificadores de histonas para mutagénese. Considerando que os métodos acima mencionados exigem frequentemente a utilização de, pelo menos, algumas sequências dentro da ORF do gene alvo para dirigir recombinação homóloga, a técnica aqui descrita faz uso das sequências que flanqueiam as ORFs dos genes de histonas (que partilhem menos homologia de sequência) para o passo de recombinação, aumentando assim a probabilidade de sucesso de mutagénese direccionamento ao local desejado. Além disso, as regiões homólogas que impulsionam a recombinação pode ser muito extensa, contribuindo para a eficiente recombinação homóloga alvo.