gerichte<em> In Situ</em> Mutagenese van histon genen in gist

De vier kern histon-eiwitten H2A, H2B, H3, H4 en spelen een centrale rol in de verdichting, organisatie en functie van eukaryote chromosomen. Twee sets van elk van deze histonen vormen de histon octameer, een moleculaire spoel dat de verpakking van ~ 147 basenparen van DNA rond zichzelf richt, uiteindelijk resulterend in de vorming van een nucleosoom ^1. Nucleosomen actief deel aan een verscheidenheid van chromosoom processen, zoals de regulering van gentranscriptie en de vorming van heterochromatine en euchromatine in chromosomen, en als zodanig zijn de focus van intens onderzoek in de loop van de afgelopen decennia. Een aantal mechanismen beschreven waarmee nucleosomen kan worden gemanipuleerd op een manier die uitvoering van specifieke processen vergemakkelijken – deze mechanismen omvatten posttranslationele modificatie van histon residuen, ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling en ATP-onafhankelijke nucleosoom reorganisatieen montage / demontage ^{2, 3.}

De gist Saccharomyces cerevisiae is een bijzonder krachtige modelorganisme voor het begrijpen van histone functie in eukaryoten. Dit is grotendeels te wijten aan de hoge mate van evolutionaire conservering van het histon eiwitten gehele domein Eukarya en de ontvankelijkheid van gist aan een verscheidenheid van genetische en biochemische experimentele benaderingen ^4. Omgekeerde genetische technieken in gist zijn op grote schaal gebruikt om de effecten van specifieke histon mutaties op de verschillende aspecten van chromatine biologie bestuderen. Voor deze soorten experimenten is het vaak de voorkeur om cellen waarin het mutant histonen tot expressie gebracht vanaf hun eigen genomische loci, zoals expressie van autonome plasmiden gebruik kan leiden tot abnormale intracellulaire niveaus van histon eiwitten (vanwege variërende aantallen plasmiden in cellen) en gelijktijdige wijziging van chromatine environments, die uiteindelijk de interpretatie van de resultaten kan verwarren.

Hier beschrijven we een PCR-gebaseerde techniek die het mogelijk maakt voor gerichte mutagenese van histon genen op hun oorspronkelijke genomische locaties die geen kloneringsstap en resulteert in het genereren van de gewenste mutatie (s) zonder overgebleven exogene DNA-sequenties in het genoom vereist. Deze techniek maakt gebruik van een efficiënte homologe recombinatie systeem in gist en heeft een aantal kenmerken gemeen met andere soortgelijke technieken ontwikkeld door andere groepen – vooral de Delitto Perfetto, plaatsspecifieke genomische (SSG) mutagenese en kloneren vrij-PCR allel vervangingsmethoden ^{5, 6, 7.} De techniek beschrijven we de beeldverhouding dat maakt het bijzonder geschikt voor mutagenese van histon-genen. In haploïde gistcellen, elk van de vier kernhistonen wordt gecodeerd door twee niet-allelic en zeer homologe genen: bijvoorbeeld, histon H3 wordt gecodeerd door de HHT1 en HHT2 genen, en de open leesramen (ORFs) van beide genen dan 90% identiek in sequentie. Deze hoge mate van homologie kunnen experimenten ontworpen om specifiek op een van de twee-histon coderende genen voor mutagenese bemoeilijken. Dat voornoemde werkwijzen vereisen vaak het gebruik van ten minste enkele sequenties binnen het ORF van het doelwitgen homologe recombinatie drijven de techniek hier beschreven maakt gebruik van sequenties die het ORF van het histon-genen (die veel minder sequentiehomologie delen) voor de recombinatie stap, waardoor de kans op succesvolle targeting van mutagenese verhogen tot de gewenste locus. Bovendien kan de homologe gebieden die recombinatie rijden zeer omvangrijk zijn, wat verder bijdraagt ​​aan efficiënte gerichte homologe recombinatie.