Hedeflenen<em> In situ</emBudding Maya> Mutajenezis Histon ve Genler
Summary
A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.
Abstract
We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.
Introduction
Dört çekirdekli histon proteinleri H2A, H2B, H3, H4 ve ökaryotik kromozomların sıkıştırma, organizasyon ve fonksiyonunda önemli rol oynarlar. Bu histonlar her iki set sonuçta nükleozom 1 oluşumu ile sonuçlanır, histon oktameri, kendi etrafında DNA ~ 147 baz çifti sarma yönlendiren bir molekül makara oluşturur. Nükleozomlar bu tür kromozom üzerinde gen transkripsiyonu düzenlenmesi ve ökromatin oluşumu ve heterokromatin olarak kromozom tabanlı süreçleri, çeşitli aktif katılımcılar vardır ve gibi, son birkaç on yıl boyunca yoğun bir araştırmanın odak noktası olmuştur. Bu mekanizmalar histon kalıntılarının sonrası modifikasyon, ATP-bağımlı nükleozom remodeling ve ATP-bağımsız nükleozom yeniden düzenlenmesi dahil – bir takım mekanizmalar hangi nükleozom belirli işlemlerin uygulanmasını kolaylaştırabilir yollarla manipüle edilebilir tarif edilmiştirve montaj / demontaj 2, 3.
Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae ökaryotlarda histon işlevinin anlaşılması için özellikle güçlü bir model organizmadır. Bu büyük ölçüde etki ökaryotlarının boyunca histon proteinlerinin evrimsel korunması yüksek derecede ve genetik ve biyokimyasal deneysel çeşitli maya amenability isnat edilebilir 4 yaklaşır. maya Ters genetik yaklaşımlar yaygın kromatin biyolojinin çeşitli yönlerine ilişkin belirli histon mutasyonların etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur. deneyler bu tür için anormal hücre içi (nedeniyle hücrelerde plazmidlerin sayıları değişen) histon proteinleri seviyeleri ve yol açabilir bağımsız plazmidlerden ifade mutant histonlar kendi ana genomik lokusları eksprese edildiği hücrelerin kullanımı genellikle tercih edilir kromatin tr eş zamanlı değişikliksonuçta sonuçların yorumunu karıştırabilir vironments.
Burada, genomu içinde kalan eksojen DNA sekansları olmadan arzu edilen mutasyon (lar) ın üretiminde bir klonlama aşaması ve sonuç gerektirmez kendi ana genomik konumlarda histon genlerinin hedeflenen mutagenezi için izin veren bir PCR bazlı teknik açıklar. Bu teknik, maya etkili homolog rekombinasyon sistemi yararlanır ve diğer gruplar tarafından geliştirilen diğer benzer teknikler ile ortak birçok özelliğe sahiptir – özellikle Delitto Perfetto, alana özgü genomik (SSG) mutajenez ve klonlama içermeyen PCR bazlı alel yedek yöntemleri 5, 6, 7. Bununla birlikte, tarif tekniği özellikle histon gen mutagenezi için çok uygundur hale getiren bir yönü vardır. haploid maya hücreleri, dört çekirdek histon her iki olmayan a göre kodlanmıştırllelic ve yüksek ölçüde homolog genlerin: Örneğin, histon H3 HHT1 ve HHT2 genleri tarafından kodlanan ve iki genin açık okuma çerçeveleri (ORF'ler), sırayla% 90 üzerinde özdeştir. homoloji Bu yüksek derecede spesifik mutagenez için iki histon-kodlayan genlerin biri hedef için tasarlanmış deneyler karmaşık hale getirebilir. Yukarıda bahsedilen yöntemler genellikle homolog rekombinasyon sürücü hedef genin ORF içinde en azından bazı dizilerin kullanılmasını gerektirir ise, burada tarif tekniği için (daha az sekans benzerliği paylaşan) histon gen ORF eteklenen dizileri kullanır rekombinasyon adımı ve böylece arzu edilen mahaline mutagenez başarılı hedefleme olasılığını arttırır. Ayrıca, rekombinasyonu sürücü homolog bölgeleri daha verimli hedeflenen homolog rekombinasyon katkıda çok geniş olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Haploid S. cerevisiae hücreleri dört temel histon proteinlerinin her biri için kod özel mutagenez için iki genin biri hedeflemek isteyen araştırmacılar için bir meydan okuma temsil edebilir olmayan iki alel genler arasındaki dizi homoloji yüksek düzeyde. Daha önce sık kullanan, Delitto Perfetto, alana özgü genomik (SSG) mutajenez ve klonlama içermeyen PCR bazlı alel değiştirme yöntemleri 5, 6, 7…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Reine Protacio for helpful comments during the preparation of this manuscript. We express our gratitude to the National Science Foundation (grants nos. 1243680 and 1613754) and the Hendrix College Odyssey Program for funding support.
Materials
| 1 kb DNA Ladder (DNA standards) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agarose | Sigma | A5093-100G | |
| Boric Acid | Sigma | B0394-500G | |
| dNTP mix (10 mM each) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| EDTA solution (0.5M, pH 8.0) | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E4884-500G | |
| Lithium acetate dihydrate | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Thermal Cycler | BioRad | 170-9703 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase) and 5X buffer | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Salmon sperm DNA solution | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (Tris base, powder form) | Sigma | T1378-1KG | |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Taq Polymerase and 10X Buffer | New England BioLabs | M0273X | |
| Toothpicks | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1M, pH 8.0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| a-D(+)-Glucose | Fisher Scientific | AC170080025 | for yeast media |
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | for yeast media |
| Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | for YPD medium |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | for YPD medium |
| 4-aminobenzoic acid | Sigma | A9878-100G | for complete minimal dropout medium |
| Adenine | Sigma | A8626-100G | for complete minimal dropout medium |
| Glycine hydrochloride | Sigma | G2879-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Alanine | Sigma | A7627-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Arginine monohydrochloride | Sigma | A5131-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma | A8381-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Aspartic acid sodium salt monohydrate | Sigma | A6683-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma | G2128-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamine | Sigma | G3126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma | H8125-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Isoleucine | Sigma | I2752-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Leucine | Sigma | L8000-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma | L5626-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Methionine | Sigma | M9625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Phenylalanine | Sigma | P2126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Serine | Sigma | S4500-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Threonine | Sigma | T8625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tryptophan | Sigma | T0254-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tyrosine | Sigma | T3754-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Valine | Sigma | V0500-100G | for complete minimal dropout medium |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | for complete minimal dropout medium |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | for complete minimal dropout medium |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | for complete minimal dropout medium |
| Yeast Nitrogen Base | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | for complete minimal dropout medium |
| 5-Fluoroorotic acid (5-FOA) | AmericanBio | AB04067-00005 | for 5-FOA medium |
References
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Rando, O. J., Winston, F. Chromatin and transcription in yeast. Genetics. 190 (2), 351-387 (2012).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Storici, F., Resnick, M. A. Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides. Genet Eng (N Y). 25, 189-207 (2003).
- Gray, M., Kupiec, M., Honigberg, S. M. Site-specific genomic (SSG) and random domain-localized (RDL) mutagenesis in yeast. BMC Biotechnol. 4, 7 (2004).
- Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Cloning-free PCR-based allele replacement methods. Genome Res. 7 (12), 1174-1183 (1997).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Lundblad, V., Hartzog, G., Moqtaderi, Z. Manipulation of cloned yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
- Hoffman, C. S. Preparation of yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
- Treco, D. A., Lundblad, V. Preparation of yeast media. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
- Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J Bacteriol. 63 (3), 399-406 (1952).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
- Johnson, P., et al. A systematic mutational analysis of a histone H3 residue in budding yeast provides insights into chromatin dynamics. G3 (Bethesda). 5 (5), 741-749 (2015).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41 (7), 4336-4343 (2013).
- Cross, S. L., Smith, M. M. Comparison of the structure and cell cycle expression of mRNAs encoded by two histone H3-H4 loci in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 8 (2), 945-954 (1988).
- Libuda, D. E., Winston, F. Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 443 (7114), 1003-1007 (2006).
