Propagação em pequena escala de iPSCs humano em condições sem soro para a caracterização imunocitoquímica de rotina
Summary
Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.
Abstract
There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.
Introduction
Reprogramação de células somáticas adultas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) fornece uma maneira de obter uma fonte potencialmente ilimitada de células específicas do paciente para estudar a doença 1, 2. Recapitulando um fenótipo da doença in vitro, que tornam plausível para examinar os mecanismos celulares e moleculares associadas com a doença, e melhorar a descoberta da droga e da medicina personalizada 3. Além disso, iPSCs humanos (hiPSCs) oferecem a possibilidade de derivar tipos de células específicas que podem ser usadas como um recurso único para substituir as células mortas ou disfuncionais e restaurar a função no contexto de várias desordens 4, 5.
Um pré-requisito importante para usando iPSCs nas aplicações acima é garantir que a sua pluripotentes e indiferenciado estado é mantido durante a expansão em cultura. Tipicamente, techniqUEs, tais como citometria de fluxo, Western blotting, reacção em cadeia com polimerase e os ensaios funcionais, que requerem grandes quantidades de células e equipamento especializado, são utilizados para a análise detalhada de iPSC pluripotência 6, 7, 8, 9, 10. No entanto, a avaliação de rotina do estado indiferenciado das iPSCs pode efetivamente ser alcançado através da propagação limitada destas células especificamente para imunocitoquímica (ICC), envolvendo, assim, tempo e recursos reduzidos.
Recentes avanços permitir o crescimento de iPSCs em condições isentas de soro definidas, o que é uma melhoria significativa em relação aos sistemas de cultura convencionais que requerem camadas alimentadoras de fibroblastos murinos e meio de soro contendo. No entanto, a literatura atual não inclui protocolos passo a passo claras que descrevem como fazer a transição iPSCs de alimentadorcamada para sistemas sem alimentação.
Neste contexto, o presente protocolo sistematicamente detalha como hiPSCs cultivadas em ratinho irradiado fibroblasto embrionário (IMEF) camadas alimentadoras podem ser (1) adaptado para propagar em meio isento de soro, e (2) em cultura em pequena escala para apoiar especificamente robusta análise imunocitoquímica. No geral, esta metodologia representa um procedimento oportuna e rentável para a propagação iPSCs humanos em condições isentas de soro para confirmar a sua pluripotência em uma base de rotina usando imunocitoquímica.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo sistemática aqui apresentado oferece uma economia de tempo e método de custo-benefício, na forma de uma técnica de cultura em escala reduzida, projetado especificamente para apoiar a análise pluripotência eficaz através de imunocitoquímica.
As principais vantagens do método descrito são as seguintes. Tradicionalmente, mais de 3 a 4 passagens são necessários para a transição iPSCs de camadas alimentadoras para Alimentador livre condições de cultura, a fim de elimin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding Sources: The University of Arizona, The Jim Himelic Foundation, and the Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.
Materials
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5X Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldeyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1X Phoshate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25mm sizes |
References
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