רבייה בקנה מידה קטנה של iPSCs האנושי בתנאי סרום ללא לאפיון Immunocytochemical שיגרתי
Summary
Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.
Abstract
There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.
Introduction
תכנות מחדש תאים סומטיים אדם בוגרים לתאי גזע מושרים (iPSCs) מספק דרך להשיג אספקה פוטנציאלית בלתי מוגבלת של תאים ספציפיים למטופל ללמוד המחלה 1, 2. משחזר פנוטיפ מחלה במבחנה תעשה את זה מתקבל על דעת לבחון מנגנונים תאיים ומולקולריים הקשורים במחלה, ולשפר גילוי סמי רפואה מותאם אישית 3. בנוסף, iPSCs האדם (hiPSCs) להציע את היכולת להפיק סוגי תאים מסוימים אשר ניתן להשתמש בהם כמשאב ייחודי להחליף תאים מתים או לא מתפקדת ולשחזר פונקציה בהקשר של מספר הפרעות 4, 5.
תנאי חשוב לשימוש iPSCs שמוצג ביישומים לעיל הוא להבטיח כי מדינת pluripotent ו המובחנת שלהם נשמרת במהלך התרחבות בתרבות. בדרך כלל, techniqUES כגון cytometry זרימה, סופג מערבי, תגובת שרשרת פולימראז מבחנים תפקודיים, אשר דורש כמויות גדולות של תאים וציוד מיוחד, משמש לניתוח המפורט של pluripotency 6 iPSC, 7, 8, 9, 10. עם זאת, הערכה שיגרתית של המדינה המובחנת 'iPSCs עשויה להיות מושגת בצורה יעילה באמצעות ההתפשטות המוגבלת של תאים אלה במיוחד עבור immunocytochemistry (ICC), ובכך מעורבים זמן נמוך ומשאבים.
התקדמות שחלה באחרונה לאפשר לצמיחת iPSCs בתנאי סרום ללא מוגדר, וזה שיפור משמעותי על פני מערכות התרבות קונבנציונליות שדורשות שכבות מזין פיברובלסטים murine ומדיה המכיל סרום. אולם, הספרות הנוכחית אינה כוללת פרוטוקולים בשלבים ברורים המתארים כיצד מעבר iPSCs מזיןשכבה למערכות מזינות חינם.
בהקשר זה, בפרוטוקול הנוכחי מפרט באופן שיטתי כיצד hiPSCs גדל על פיברובלסטים מוקרן עכבר עוברי (iMEF) שכבות מזין יכול להיות (1) מותאמת להפיץ במדיום סרום ללא, ו (2) בתרבית על בקנה מידה קטנה במיוחד לתמוך חזק ניתוח immunocytochemical. בסך הכל, מתודולוגיה זו מייצגת הליך בזמן וחסכוני עבור הפצת iPSCs האנושי בתנאים סרום ללא לצורך וידוא pluripotency שלהם על בסיס שגרתי באמצעות immunocytochemistry.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול השיטתי שהוצג כאן מציע timesaving ושיטה חסכונית, בצורת טכניקת תרבות מוקטנת, שתוכנן במיוחד כדי לתמוך ניתוח pluripotency יעיל באמצעות immunocytochemistry.
היתרונות העיקריים של המתודולוגיה שתוארה הם כדלקמן. באופן מסורתי יותר 3 עד 4 קטעים נדרשי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding Sources: The University of Arizona, The Jim Himelic Foundation, and the Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.
Materials
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5X Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldeyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1X Phoshate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson’s disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
