Rutin İmmünositokimyasal Karakterizasyonu için serum serbest şartlar İnsan iPSCs küçük ölçekli Yayılım
Summary
Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.
Abstract
There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.
Introduction
Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine insan yetişkin somatik hücre yeniden programlama (iPSCs) Hastalık 1, 2 incelemek için hastaya özgü hücrelerin bir potansiyel olarak sınırsız kaynağı elde etmek için bir yol sağlar. In vitro bir hastalık fenotipi yansıtan bu makul hastalığı ile ilişkili hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek yapmak ve uyuşturucu keşif geliştirmek ve tıp 3. kişiselleştirilmiş olur. Buna ek olarak, insan iPSCs (hiPSCs) ölü ya da işlevsiz hücrelerinin yerini alır ve birçok hastalığın 4 kapsamında, 5 fonksiyonu geri eşsiz bir kaynak olarak kullanılabilecek özel hücre tipleri kaynaklanan imkanı sunuyoruz.
Yukarıdaki uygulamalarda iPSCs kullanarak önemli bir ön koşul kendi pluripotent ve farklılaşmamış devlet kültüründe genişleme sırasında muhafaza edilmesini sağlamaktır. Tipik haliyle, TECHNIQhücre ve özel ekipman büyük miktarlarda ihtiyaç gibi akış sitometrisi, Western blotting, polimeraz zincir reaksiyonu ve işlevsel tahlilleri gibi daah, iPSC pluripotensin 6, 7, 8, 9, 10, ayrıntılı analiz için kullanılmıştır. Ancak, iPSCs 'farklılaşmamış devletin rutin değerlendirme etkin şekilde azaltılmış zaman ve kaynak içeren, özellikle immünsitokimya (ICC) için bu hücrelerin sınırlı yayılımı yoluyla elde edilebilir.
Son gelişmeler, murin fibroblast besleyici tabakalar ve serum ihtiva eden ortam gerektiren geleneksel kültür sistemlerine göre önemli bir gelişmedir tanımlanan serumsuz koşullarda iPSCs büyümesi izin verir. Bununla birlikte, mevcut literatür besleyici iPSCs geçiş anlatan net adım adım protokolleri içermezbesleyici içermeyen sistemlere tabaka.
Bu bağlamda, bu protokol, sistematik olarak ışınlanmış fare embriyonik fibroblast üzerinde büyümüş hiPSCs (IMEF) besleyici tabakalar (1) olarak, serumsuz ortam içinde yayılması için uyarlanmış, ve (2), bir küçük ölçekte kültürlendi özellikle sağlam bir destek nasıl detayları immünositokimyasal analizi. Genel olarak, bu yöntem, immünsitokimya kullanarak rutin olarak kendi pluripotensini teyit etmek için, serum içermeyen koşullar insan iPSCs yaymak için zamanında ve düşük maliyetli bir prosedür gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan sistematik protokol özellikle immünsitokimya yoluyla etkili Pluripotency analizini desteklemek için tasarlanmış bir küçültülmüş kültür tekniği şeklinde bir zaman kazandıran ve maliyet-etkin bir yöntem, sunmaktadır.
şöyle tarif metodolojinin temel avantajlarıdır. Geleneksel olarak en fazla 3 ila 4 geçitler 12, 13 görünmesini dökme ayrılma tekniklerinin kullanımı sonrası kalan iMEFs ortadan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding Sources: The University of Arizona, The Jim Himelic Foundation, and the Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.
Materials
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5X Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldeyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1X Phoshate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25mm sizes |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson’s disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
