JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
español

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

La cuantificación rápida de Blastogénesis inducida por mitógeno de linfocitos T para identificar fármacos inmunomoduladores

Published: December 27, 2016
doi:
10.3791/55212
, , ,
1Department of Neuroscience, Cell Biology and Physiology, Boonshoft School of Medicine,Wright State University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Boonshoft School of Medicine,Wright State University

Summary

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

Abstract

La proliferación de linfocitos en respuesta a la estimulación antigénica o mitogénica es un fenómeno difícil de cuantificar útil para inmunomodulador prueba (es decir, inmunosupresor o inmunoestimulante) compuestos químicos y biológicos. Uno de los primeros pasos durante la mitogénesis es el agrandamiento celular o transformación blastogénica, después de lo cual el volumen de células se incrementa antes de la división. Por lo general es detectable en las primeras horas de la estimulación de linfocitos T. A continuación, describimos un método rápido para cuantificar la blastogénesis de los linfocitos T aisladas a partir de bazos de ratón y células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) utilizando un contador de células automatizado. Varios ensayos de proliferación utilizados comúnmente en su mayor parte son laboriosos y sólo reflejan el efecto de la población general en lugar de los efectos celulares individuales dentro de una población. En contraste, el ensayo contador de células automatizado presentado proporciona mediciones rápidas, directas y precisas de diámetros de células que pueden serutilizado para evaluar la eficacia de diversos mitógenos y fármacos inmunomoduladores in vitro.

Introduction

Los linfocitos T son las células primarias responsables de la inmunidad adaptativa en los mamíferos. Se sabe que responden a los péptidos antigénicos específicos presentados por moléculas MHC en la superficie de células presentadoras de antígeno. Tras la activación de un receptor de células T cognado (TCR), la célula aumenta de tamaño en un proceso denominado transformación blastogénica, o blastogénesis. Este proceso es detectable en la primera ~ 6 hr después del estímulo se aplica 1. Durante blastogénesis, los volúmenes de las células T individuales incremento de 2 a 4 veces 2-6. Los linfocitos comienzan a proliferar en un proceso llamado expansión clonal, el propósito de los cuales es el de generar el mayor número de clones de las células específicas de antígeno TCR que devengan como sea posible. Las células de la progenie a continuación, ejercen su función inmunológica por diferenciarse en citotóxicos (CD8 +) o helper (CD4 +) linfocitos T efectores. Por lo tanto, los linfocitos T vírgenes en la sangre humana o de ratón están en la fase G 0 (en reposo) de la célulaciclo y apoyo a la actividad metabólica mínima. Tras la exposición a antígenos o mitógenos, las células T vuelven a entrar en el ciclo celular, con una estimulación concomitante de la síntesis de la transcripción y de la proteína 7-10. Mitógenos, tales como forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina estimular los linfocitos a través de la activación de la proteína quinasa C (PKC) y Ca 2+ vías de señalización dependiente 1. La activación de las células T con PMA / ionomicina no pasa por los pasos de señalización de TCR.

En la proliferación de ensayos in vitro son ampliamente utilizados para el propósito de evaluar la función de linfocitos y la respuesta a los estímulos. lecturas de proliferación se toman típicamente de uno a tres días después del comienzo de la estimulación de células T y reflejan el estado colectivo de cientos o miles de células. La potencia de varios mitógenos y fármacos inmunomoduladores in vitro puede ser evaluada por la simple medición de las tasas de proliferación en presencia de estos compuestos. Algunos de éstos unassays y sus limitaciones se discuten a continuación.

Para el recuento del número de células directa, el procedimiento es mucho tiempo, con una alta probabilidad de errores de manejo.

Para la síntesis de ADN, el ensayo de incorporación de 3H-timidina mide la síntesis de ADN, pero su principal limitación es su radiotoxicidad. Una alternativa no radiactiva es BrdU, pero el rango de respuesta lineal para el crecimiento celular es limitada, y no se requiere tratamiento de anticuerpos, lo que aumenta el número de pasos en el procedimiento 11,12.

Para la actividad metabólica, las sales de tetrazolio (MTT, MTS, XTT, y WST-1) y resazurina ensayos colorimétricos basadas en colorantes informan del estado metabólico general de la división de las poblaciones de células. Sin embargo, MTT no es soluble en el medio de cultivo, lo que requiere pasos adicionales de lavado, incorporando así los errores en la medición; XTT necesita componentes adicionales para reducir de manera eficiente; MTS-, WST-1-, y mediciones basadas en resazurina son afectaed por el medio de cultivo y su pH componentes del suero, albúmina o rojo de fenol 13-16. Estos ensayos no miden el número real de células viables sino más bien estiman las actividades enzimáticas combinadas. Por lo tanto, la tasa de proliferación no puede determinarse con precisión mediante ensayos metabólicos debido a la correlación no lineal entre el número de células y la reducción de colorante 12,17.

Para medir la concentración de ATP, de las células T aumenta la activación inducida en ATP se correlacionan con la proliferación. Sin embargo, la elevación de ATP intracelular es uno de los pasos iniciales de la activación de células T; muchos pasos atrás es la proliferación actual 17,18.

Para el ensayo de dilución de colorante, colorante fluorescente CFSE tiñe las células mediante la unión covalente a las proteínas intracelulares. El colorante muestra una disminución dependiente de la proliferación en la intensidad de fluorescencia, que puede realizar el seguimiento del número de divisiones celulares. Sin embargo, debido etiquetado proteína covalente, las funciones de estoslas proteínas pueden ser comprometidas. El colorante es tóxico para las células en concentraciones más altas. En concentraciones de colorante más bajas, sin embargo, la intensidad inicial de la fluorescencia se reduce, disminuyendo el número de divisiones celulares que pueden ser seguidos. Además, después de marcar con CFSE, hay una proliferación independiente de ~ 50% de pérdida de la fluorescencia inicial durante el primer período de 24 a 48 hr, lo que limita el rango dinámico de este ensayo 19,20.

La mayoría de estos ensayos reflejan el estado colectivo de grandes números de células y requieren el tratamiento de las células con tintes fluorescentes. Las células necróticas y apoptóticas también podrían contribuir a estas medidas, a menos que se eliminan del análisis por tinción con productos químicos o anticuerpos.

Blastogénesis de linfocitos puede ser evaluada por una variedad de métodos, tales como la microscopía óptica o citometría de flujo 4,21,22. A continuación, describimos un método rápido para la medición de tamaños de células T usando unan automatizado contador de células, que recoge imágenes de células en tiempo real que se almacenan y se pueden volver a analizarse en un momento posterior. Además de las mediciones de tamaño, este dispositivo proporciona el número de células precisas y el porcentaje de células viables, como se determina por exclusión de tripan mancha azul. El dispositivo utilizado en este protocolo está disponible comercialmente, y el fabricante a prueba la precisión del instrumento usando tres instrumentos diferentes y varios controles de concentración y viabilidad. Los resultados de estos estudios demostraron un coeficiente de varianza que era generalmente inferior a 6%. Como se ha indicado en el protocolo, el dispositivo se calibra de forma regular con 6 micras y 8 micras perlas de poliestireno de diámetro. Las ventajas de utilizar un contador de células para diferenciar entre las células T en reposo y linfoblastos T a base de diámetro de la celda es la facilidad de uso y la naturaleza automatizada del análisis. El software es capaz de dibujar un círculo alrededor de cada célula y calcular el diámetro de la célula. Además, el imlas edades son visibles para el operador, que puede verificar la exactitud del instrumento en la identificación de las células y correcta de dibujar un círculo alrededor de ellos. En términos de limitaciones, el instrumento no es per se puede diferenciar entre los escombros y las células; por lo tanto, es importante que el operador ve cada imagen, ya que se está procesando. Hay un potencial para la incorporación de burbujas de aire, lo cual disminuirá el número de campos utilizables para el análisis; sin embargo, esto es raro si no se realiza el mantenimiento de lavado regular.

En este estudio, los grupos de linfocitos T esplénicas se estimularon con ionomicina y concentraciones crecientes de PMA para 12 a 48 hr. concentraciones de PMA tan bajas como 2 ng tanto una respuesta blastogénica / ml inducida robusto y proliferación significativa. Las mediciones de los efectos de varios fármacos, como la inmunosupresores ciclosporina A (CsA), FK506 (tacrolimus), y rapamicina (sirolimus), así como bloqueadores de los canales de iones TRAM-34 y FTY720 (fingolimod), en blastogénesis demostró buena concordancia con los efectos descritos sobre la proliferación. La respuesta blastogénica de PBMCs humanos a la estimulación con PMA / ionomicina y murina de células T con anti-CD3 y anti-CD28 perlas recubiertas de anticuerpos magnéticos también se midieron.

El ensayo contador de células cuantifica tanto blastogénesis y la tasa de proliferación (densidad celular) al mismo tiempo, pero por separado, a diferencia de los métodos antes mencionados, que se parecen a una combinación de estos efectos. El protocolo presentado proporciona una técnica rápida y robusta para la evaluación de la potencia de los agentes mitogénicos y inmunomoduladores.

Protocol

Todos los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por la Junta Universitaria Laboratorio Cuidado de Animales y el empleo Comisión de Revisión Institucional y el estado de Wright. NOTA: PBMCs humanos se aíslan por el gradiente de densidad método de centrifugación Ficoll 5. 1. Bazo cosecha Casa adultos ratones hembra ICR en condiciones de laboratorio estándar con los alimentos, agua, ropa de cama y los requisitos específicos para la especie. NOTA: Los animales tenían una edad media de 2,9 meses y un peso promedio de 30.4 g en el momento de la eutanasia. En la fecha de aislamiento (DOI), la eutanasia a los animales de forma individual sin otros animales conspecific presentes. Hacer todos los esfuerzos para garantizar un mínimo de estrés para el ratón. La eutanasia utilizando CO 2 con dislocación cervical secundaria para asegurar la muerte. Colocar el animal, aún dentro de la jaula de transferencia, en la cámara de CO 2 y stata el flujo de gas a 5 L / min. Esta velocidad de flujo desplaza el oxígeno en el recomendado 10 a 30% por min. Después de que el animal está inconsciente, aumentar la velocidad de flujo de CO 2 a 15 L / min. Compruebe el animal para el cese de la respiración y dejar en la cámara durante 2 minutos adicionales. Aplicar dislocación cervical con fuerza de distracción para asegurar la muerte. Se recoge el bazo del animal utilizando una técnica aséptica dentro de 10 min de la muerte. Esterilizar dos juegos de tijeras y pinzas para la extracción del bazo en un autoclave horno antes de su uso. Esterilizar la superficie de la disección mediante la aplicación de 70% de etanol. Aplicar 70% de etanol en el abdomen del ratón. El uso de un conjunto de tijeras y pinzas, hacer un corte en el pelaje y la piel desde el lado izquierdo del abdomen, a continuación, tire de distancia y remueva la piel para revelar el peritoneo. Una vez expuesto, aplicar la solución de clorhexidina al 4% antes de abrir el peritoneo. El uso de la segunda serie de cienciassors y fórceps, hacen un corte de 2 a 3 cm a lo largo del abdomen central. Abrir el peritoneo y extirpar el bazo mediante el corte de los archivos adjuntos y el exceso de grasa visceral. Coloque el bazo en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). 2. Preparación de esplenocitos primas NOTA: Realizar todos los pasos bajo un gabinete de flujo laminar de bioseguridad mediante una técnica aséptica. Remojar los bazos recolectadas en 10 ml de H desionizada estéril 2 O durante 5 minutos en una placa de cultivo de 10 cm para lisar los eritrocitos de la superficie. Nota: Este paso se puede omitir si el bazo fue dañada durante el aislamiento. Para liberar los esplenocitos, aplastar los bazos entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados (lado esmerilado frente al bazo) a través de una placa de 10 cm de cultivo fresco. Mezclar con 10 ml de RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, 50 UI / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina (a continuación se refiere a unas RPMI completo). Filtrar las células a través de una 40 micras filtro de células de nylon estéril en una nueva placa de cultivo de 10 cm para eliminar el tejido conjuntivo y los residuos. Lyse los eritrocitos restantes mediante la adición de 20 ml de tampón de lisis RBC compuestos por 155 mM NH 4 Cl, 10 mM NaHCO 3, y EDTA 0,1 mM a pH 7,4 y ~ 300 mOsm / L. NOTA: La osmolalidad se mide por un punto de congelación o un osmómetro de presión de vapor. Transferencia de las células de la placa de 10 cm a un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 250 xg durante 10 min (4 ° C). Eliminar el sobrenadante, añadir 20 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos, y volver a suspender las células sedimentadas con la pipeta. Incubar a temperatura ambiente en el tampón de lisis durante 10 minutos con agitación suave. Centrifugar durante 10 min a 250 xg (4 ° C) para sedimentar las células. Retirar el tampón de lisis. células Vuelva a suspender en 10 ml de RPMI completo y se centrifuga de nuevo (250 xg, 10 min, 4 ° C). DesctARD El sobrenadante. Vuelva a suspender los esplenocitos en 2 ml de RPMI completo se calentó a 37 ° C para la transferencia a la columna de la fibra de lana de nylon. 3. Purificación de los linfocitos T Lavar las columnas de lana de nylon dos veces con 5 ml de RPMI completo. Incubar a 37 ° C en un CO 2 incubadora de cultivo celular 5% durante 1 hora. NOTA: Es imprescindible para mantener la lana de nylon húmedo durante la duración del experimento y utilizar RPMI completo calentó a 37 ° C para todos los pasos de aislamiento de lana de nylon. Añadir esplenocitos aislados a la columna y se incuba durante 1 hora para permitir que las células B, fibroblastos, y células accesorias a que se adhieran a la lana de nylon. Añadir 2 ml de RPMI que contienen los esplenocitos en la columna y pasar a través hasta que se alcance la parte superior de la lana de nylon. Añadir 2 ml de RPMI completo se calentó a 37 ° C en la parte superior de la lana de nylon y pasar el medio a través de la lanahasta que el nivel del líquido alcanza la superficie superior. Añadir 3 ml de calentamiento RPMI completo a la columna para cubrir completamente la lana de nylon. Incubar la columna cargada sin problemas en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo celular durante 1 hora. Eluir las células por lavado de la columna dos veces con 5 ml de RPMI completo. Realizar un lavado adicional de las células eluidas mediante centrifugación. Llenar la columna a la parte superior 2 veces con RPMI completo y permitir que la solución en la columna fluya a través en un tubo cónico estéril de 50 ml. NOTA: Evitar tocar o golpear la columna, que se pueden desprender las células B, células accesorias, y los fibroblastos se adhieren a la lana de nylon. Recoger la fracción de flujo a través y centrifugado a 250 xg durante 10 min (4 ° C) para sedimentar las células. Lavar una vez con 10 ml de RPMI completo. Sedimentar las células de nuevo (250 xg, 10 min, 4 ° C) y volver a suspender en 2 ml de RPMI completo. Medir la c densidad ell usando un hemocitómetro y se diluye en RPMI completo a 0,5 x 10 6 células / ml. Seed 1 o 2 ml alícuotas de células en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 ó 6 pocillos, respectivamente, y cultivar las células a 37 ° C con 5% de CO 2. NOTA: 1 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT) se puede añadir a cada pocillo en esta fase para mejorar la supervivencia de células T. Opcional: Confirmar la eficiencia del protocolo de aislamiento por citometría de flujo. Este protocolo produce normalmente ~ 80% de los linfocitos T 23. Nota: las de lana purificado de nylon contienen aproximadamente 50% de células CD4 + y 23% de CD8 + células. Para purificar el CD4 + y CD8 + subpoblaciones más, una única etapa de agotamiento inmunomagnética se puede realizar utilizando ocho anticuerpos y perlas magnéticas 24. Alternativamente, más pura CD4 + y las poblaciones de células T CD8 + pueden aislarse mediante selección positiva o negativa con anticuerpos específicos. _TITLE "> 4. La activación de los linfocitos T y la exposición al fármaco experimental Activar los linfocitos T dentro de 24 h de aislamiento a través de la adición de PMA y ionomicina sal de calcio o perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD28 23,25,26 anti-CD3 y. Añadir fármacos experimentales (por ejemplo, ciclosporina, FK506, rapamicina, TRAM-34, y FTY720) en el momento de la activación. NOTA: Aquí, las concentraciones de PMA varió de 2 a 250 ng / ml, y la concentración ionomicina se mantuvo a 250 nM. Si es posible, las diluciones deben prepararse a partir de alícuotas del stock de cada fármaco de modo que el volumen añadido a cada pocillo de células es ≥1 l para asegurar la reproducibilidad. El perlas magnéticas anti-CD3 / anti-CD28-revestido se añaden en una proporción de 1: en perlas a célula 1. Aumentar el número de granos por célula (es decir, la proporción de grano a célula) aumentará la intensidad de la estimulación 25,26. Las perlas se lavaron y se resuspendieron en RPMI completo antes de su adición a las células. Tenga en cuenta que tripanoazul tiñe las perlas. Cultivar las células durante 12-72 horas a 37 ° C con 5% de CO2 antes de analizar con el contador de células automatizado. 5. Automated Cell Collection Contador de datos Antes de ejecutar la muestra, asegúrese de que las células se mezclan suavemente con una pipeta serológica para evitar grumos. Esto es particularmente importante para los linfocitos activados por el aumento de la adhesividad. Para los cultivos que se activan con perlas anti-CD3 / CD28, después de pipetear, transferir la muestra a un tubo de centrífuga de 1,5 ml o 2 ml. Separar las perlas, manteniendo el tubo en un imán para 1-2 min. Usar el sobrenadante que contiene las células para el análisis. NOTA: analizar tanto las células en reposo y activadas dentro de 1 hr para dar cuenta de cualquier pre-activación de las células en reposo por el suero presentes en el medio de cultivo. Después de 12 h de PMA / ionomicina estimulación, un pequeño aumento en el tamaño celular era detectable (Figura 2 </strong>). A 72 hr, ningún aumento significativo tamaño de la célula en comparación con se observó 48 horas (datos no mostrados). Se transfiere 1 ml de la suspensión de células en una cubeta de muestra y ejecutarlo a través del contador de células automatizado de acuerdo a las instrucciones del manual. NOTA: Para cada uno de los ensayos, un mínimo de 1 ml (un máximo de 2 ml) de cultivo celular se debe utilizar. El contador de células automatizado utiliza una jeringa para mezclar con azul de tripano con la suspensión de células y pasa la mezcla de azul de tripano de células sobre un campo que es imaginada y analizada por el software. El software detecta las células teñidas de azul de tripano, dibuja un círculo alrededor de cada célula, y determina el diámetro. 100 imágenes se recogen de cada muestra, y la viabilidad celular y se determinan los tamaños. El umbral de detección del contador de células usada aquí tiene un límite inferior de 5 micras. Transferir datos de cada ejecución de una hoja de cálculo para su posterior análisis. Calibrar el dispositivo sobre una base regular con un 1muestra ml de 6 micras y 8 micras perlas de poliestireno de diámetro. NOTA: Los tamaños de perlas reales medidos por el fabricante para cada lote se deben utilizar, no el tamaño nominal. 6 y 8 micras perlas son convenientes porque estos diámetros se encuentran cerca de los diámetros esperados de reposo y células T activadas (ver Figura 1). 6. datos y análisis estadístico Analizar los datos utilizando el software estadístico y la representación gráfica apropiada. NOTA: La hoja de cálculo para cada ejecución contiene el número de células con cada diámetro (rango: 5 micras a 70 micras). Las células por encima de un diámetro de 17 micras se eliminan del análisis para excluir las partículas de polvo y las pequeñas burbujas, que se pueden leer las células viables por el instrumento. Realizar la prueba de hipótesis usando la prueba t de Welch para los conjuntos de datos con una varianza desigual; los resultados se consideraron estadísticamente significativos si p <0,001. La fórmula utilizada fue, <img alt = "Ecuación 1" src = "/ files / ftp_upload / 55212 / 55212eq1.jpg" /> dónde y son medias de la muestra, y son varianzas de las muestras, y y son los tamaños de muestra para cada conjunto de datos. El número de grados de libertad se estima de forma conservadora mediante el menor de los dos tamaños de muestra para cada comparación. Los gráficos de barras se presentan como la media ± SEM. 7. esplénica ensayo de proliferación de linfocitos T Medir la proliferación de células T usando un ensayo de proliferación de MTS- o lector de placas colorimétrico basado en MTT. NOTA: El ensayo es la based en el compuesto de tetrazolio MTS (reactivo de Owen) reducción al producto de formazán soluble, probablemente por la NADPH o NADH producido en las células metabólicamente activas por las enzimas deshidrogenasa. Recuento de células T purificadas con un hemocitómetro y volver a suspender en RPMI-1640 completo a una densidad final de 1 x 10 6 células / ml. NOTA: 1 mM de DTT se puede añadir a las células en esta etapa. Activar las células con PMA e ionomicina junto con fármacos de ensayo, si es necesario, y mezclar suavemente (similar al paso 4). Plate 100 l de las células en cada pocillo de una placa tratada de cultivo celular de 96 pocillos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO2 durante 48 hr. Añadir 100 l de medio RPMI-1640 sin células en un pocillo para obtener una lectura de la absorbancia de fondo. Añadir 20 l de reactivo basado en MTS a cada pocillo y se incuba a 37 ° C con 5% de CO2 durante 4 hr. Tomar mediciones de absorbancia a 490 nm usando un lector de placas. La Amediciones bsorbance corresponden al número de células metabólicamente activas en cada pocillo. NOTA: Restar los niveles de fondo si es necesario. Los valores de absorbancia de fondo dependen del tipo de medio de cultivo, suero, pH externo, y la duración de la exposición de reactivo MTS a la luz. reactivos basados ​​en MTS son sensibles a la luz, y la exposición a la luz durante varias horas pueden resultar en mayores valores de absorbancia de fondo.

Representative Results

Se utilizó este ensayo para comparar la formación de linfocitos explosión durante la estimulación con PMA, un éster de forbol y ionomicina, un ionóforo de calcio. La figura 1A muestra la distribución de frecuencias de diámetros de reposo y las células del bazo T activadas farmacológicamente. El tratamiento de las células con PMA / ionomicina durante ~ 2 días dio lugar a un cambio significativo en la mediana de la distribución hacia diámetros más grandes (véase, por ejemplo de referencia 4). El número de células con diámetros más pequeños se redujo en consecuencia. Con el fin de asegurarse de que nuestro dispositivo informó de los diámetros correctos, hemos realizado dos calibraciones con perlas de poliestireno de 6 micras y 8 micras de diámetro (véase la Tabla de Materiales). Las figuras 1B y 1C muestran las lecturas de las células T activadas superpuestas con un 8 micras células T en reposo estándar y superpuestas con un estándar de 6 micras. Figura1D muestra los tamaños de control de talón reportados por el fabricante representan frente a los diámetros medios medidos con nuestro contador de células automatizado. Parecía que el tamaño 6 micras fue ligeramente sobreestimada en nuestras mediciones, probablemente debido al umbral de medida del instrumento que tiene un límite inferior de 5 micras. Sin embargo, la desviación estándar de los diámetros del grano calculados a partir de las mediciones de contador de células estaba de acuerdo con la desviación estándar reportado por el fabricante. Llegamos a la conclusión de estos experimentos que este dispositivo se puede utilizar de forma fiable para comparar reposo y tamaños de células T de ratón estimuladas por mitógenos y que el dispositivo puede medir con precisión los diámetros celulares reales. a continuación, se procedió a probar la dependencia de la media de aumento de diámetro de la concentración de PMA y encontramos que, a una concentración fija de 250 nM ionomicina, el efecto de PMA no se ha modificado de manera significativa mediante la elevación de su concentración from 2 a 250 ng / ml (Figura 2A). Usando el ensayo basado en MTS, se midió la proliferación de células T en 50 y 250 ng PMA / ml y no se encontraron diferencias apreciables (Figura 2C), de acuerdo con nuestros datos del diámetro de la célula. El fármacos inhibidores de la calcineurina ciclosporina A (300 nM) y FK506 (1 nM) suprimió tanto blastogénesis (Figura 2B) y la proliferación (Figura 2C). La inhibición no fue completa en ambos casos, sin embargo. Las mediciones realizadas después de 12 hr PMA / ionomicina Además mostró un aumento de 7,2% y 6,8% en el diámetro de 50 ng / ml y 250 ng / ml de PMA, respectivamente (Figura 2D). Tamaño aumenta a estas dos concentraciones no fueron significativamente diferentes, como fue el caso para 48 estimulación hr (comparar con la Figura 2A). Los datos del diámetro de las células recogidas de reclinación y células T activadas después de 48 h de estimulación PMA / ionomicina se resumen en <strong> Tabla 1. La zona media de la superficie y el volumen de células T en reposo del bazo de ratones ICR fueron 151,4 m 2 y 1,9 x 10 -4 nl, respectivamente. La zona media de la superficie y el volumen de las células T activadas eran 300,6 m 2 y 5,9 x 10 -4 nl, respectivamente. El aumento del diámetro promedio general para todas las células activadas fue 40,92% (Tabla 1). También hemos probado otros compuestos químicos reportados para ser inmunosupresores: CsA, FK506, rapamicina, FTY720, y TRAM-34. En la Figura 3, las mediciones de tamaño de celda obtenidos en reposo y células T activadas en ausencia y se muestran presencia de estos fármacos. CsA y FK506, que tienen como objetivo el factor nuclear calcineurina dependiente de células T activadas (NFAT) 27,28, eran los más potentes, la inhibición de la respuesta blastogénica en casi un 72% (Figura 3A y 3B). Curiosamente, conaumento de las concentraciones de PMA, la potencia de CsA y FK506 reducido ligeramente, a pesar de que no hubo ningún aumento adicional diámetro celular en ausencia de estos medicamentos (Figura 2A y 2B). La rapamicina, un inmunosupresor que inhibe la diana de mamífero de la rapamicina (mTOR) 29,30, tuvo un efecto moderado, pero estadísticamente significativo (Figura 3A, 3B y 3C). FTY720 es una esfingosina agonista del receptor de 1-fosfato que inhibe la salida de linfocitos en circulación 31 y se ha descubierto recientemente para inhibir TRPM7, un canal catiónico altamente expresado en los linfocitos T 32. Tanto FTY720 y rapamicina tuvieron un efecto comparable sobre la blastogénesis, reduciéndolo de la media de un incremento de 52% en el diámetro a aproximadamente 34% (Figura 3A y 3B). TRAM-34 es un bloqueador del canal de potasio activado por calcio KCa3.1 33. Probado a 700 nm, TRAM-34 era ineficaz en las células T murinas, in acuerdo con un estudio reciente proliferación de células T humana; su potencia puede depender de la naturaleza y la fuerza de la estimulación mitogénica 34 (Figura 3A y 3B). 700 nM TRAM-34 fue eficaz en el bloqueo de canales KCa3.1 en nuestros experimentos de electrofisiología de pinzamiento zonal (datos no mostrados). Esta comparación se hizo entre en reposo y las células expuestas a los fármacos en múltiples ensayos en el mismo experimento en 48 hr. Cuando la rapamicina y la CsA se utilizaron juntos, blastogénesis se inhibió completamente (Figura 3C). La activación de las células T murinas con perlas magnéticas anti-CD28-revestido anti-CD3 / 72 hr para producir un aumento del 27% en el diámetro medio, que se redujo a 5% en presencia de CsA (Figura 3D). células mononucleares humanas sobre PMA activación / ionomicina durante 48 h aumentó el diámetro por 33%, y la activación en presencia de CsA disminuyó la respuesta al 23% ( <strong> Figura 4). Figura 1: Distribución de frecuencias de diámetros de células T esplénicas murinas. (A) Columnas negras indican reposo y columnas rojas indican las células activadas PMA / ionomicina (48 hr). (B) Las distribuciones de las células T esplénicas activadas superpuestas en un estándar de calibración del tamaño de partícula de 8 micras. (C) Distribución de células T en reposo superpuestas en un estándar de calibración de 6 micras. El número de células y los granos utilizados se indican en cajas. (D) La mediana de diámetro medido por el contador de células traza contra el diámetro del grano informado por el fabricante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <p class="jove_content" fo:keep-together. dentro-page = "1"> Figura 2: Dependencia de murino activación de las células T de la concentración de PMA. (A) diámetros medios de las células T sin tratar o tratados con 2, 50, y 250 ng / ml de PMA a una concentración fija ionomicina (250 nM). Mediciones (B) contador de células de reposo y (2, 50, 250 ng / ml de PMA) de las células T activadas en ausencia y presencia de CsA 300 nM o 1 nM de FK506. (C) ensayo de proliferación MTS en 50 y 250 ng / ml de PMA con 250 ionomicina nM en ausencia y en presencia de 300 nM CsA. diferencias significativas (p <0,001) se indican con asteriscos. n es el número total de ensayos. Los datos proceden de las células aisladas a partir de 3 ratones. (D) diámetros celulares de reposo y células T activadas (250 ng / ml de PMA y 250 nM ionomicina) 12 hr después de la activación en ausencia y en presencia de 300 nM CsA. pload / 55212 / 55212fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Efectos de la CsA, FK506, FTY720, rapamicina, y TRAM-34 en el tamaño de la celda. (A y C) diámetros medios de reposo y células T activadas murino ionomicina por PMA / en ausencia y en presencia de las drogas. Las concentraciones se muestran en el cuadro. (B) Los datos de un expresa como el porcentaje de incremento sobre el diámetro de las células T en reposo. la activación de linfocitos se realizó con 250 ng / ml de PMA y 250 nM ionomicina, y se tomaron las mediciones después de 48 hr. (D) Mediciones de contador de células de reposo y anti-CD3 / CD28 células T activadas, 72 hr después de la activación en ausencia y en presencia de 300 nM CsA.rge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Blastogénesis en PBMCs humanos tras la estimulación por mitógenos. (A) Columnas negras indican reposo y columnas rojas indican las PBMC activadas. (B) diámetros medios de reposo y PBMCs activadas en ausencia y en presencia de 300 nM de CsA. Las células se activaron con 250 ng / ml de PMA y 250 nM ionomicina, y se tomaron las mediciones después de 48 h de activación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. column1 de descanso Activado CsA 100 nM CsA 200 nM diámetro medio 6,94 micras 9,78 micras 8.19 micras 7,92 micras Aumento medio en diámetro 40.92% 17.88% 14.09% Superficie media 151.37 μm² 300.61 μm² 210.56 μm² 197.22 μm² Aumento medio en Superficie 98,59% 39.00% 30.16% Tabla 1: Resumen del diámetro de celda promedio y aumentos relativos de área de superficie. Las mediciones se realizaron 48 horas después de la activación con 250 ng / ml de PMA y ionomicina 250 nM.

Discussion

A continuación, describimos una técnica para la rápida detección y cuantificación de células T transformación blastogénica usando un contador de células automatizado. Bajo nuestras condiciones (250 ng / ml de PMA y 250 nM ionomicina estimulación), el área de la superficie celular se aumentó dos veces y el volumen tres veces después de 48 h de activación. El ensayo es suficientemente sensible para detectar la voladura durante la primera 12 h de activación, en el que el volumen de la célula aumentó sólo 1,25 veces en comparación con reposo (Figura 2D). Un mecanismo más fisiológicamente relevantes de la activación de células T utilizando anti-CD3 y perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo anti-CD28 produjo una respuesta blastogénica significativa, con un aumento medio de 2,3 veces en el volumen (72 hr después de la activación, la Figura 3D). Células mononucleares humanas mostraron un cambio de 2,6 veces en volumen a PMA / ionomicina estimulación durante 48 horas (Figura 4). El diámetro medio de las células T del bazo del ratón ICR y el volumen se determinó que eran6,9 micras y 1,9 x 10 -4 nl, respectivamente. PBMCs humanos (de un donante sano) tenían un diámetro medio de 7,7 micras y un volumen promedio de 2,7 x 10 -4 nl. Usando este protocolo, también a prueba concentraciones crecientes de PMA por su capacidad para activar las células T. Estos resultados unicelulares fueron consistentes con los ensayos de proliferación realizados en concentraciones similares de EPM.

Varios compuestos reportados para afectar la proliferación de células se ensayaron: FTY720 31,32; la inmunosupresores ciclosporina A, FK506, y rapamicina 27,28; y TRAM-34, un bloqueador de los canales de calcio activados por KCa3.1 33,35. Se encontró que, a las concentraciones ensayadas, los inhibidores más potentes de blastogénesis eran CsA y FK506. La rapamicina tenía un efecto supresor más pequeño pero estadísticamente significativo en la blastogénesis. TRAM-34, por otro lado, no afectó a la blastogénesis.

CsA suprime tanto la blastogénesis y proliferation, pero no completamente (Figura 2B y 2C), lo que demuestra que la medición contador de células automatizado es una buena correlación de la eficiencia de drogas en la proliferación de células T. En presencia de rapamicina junto con CsA, blastogénesis se inhibió completamente, lo que sugiere que las vías mediadas por mTOR NFAT- y en combinación pueden dar cuenta plenamente para la ampliación de las células T a la estimulación mitogénica con PMA / ionomicina (Figura 3C).

El rango dinámico de algunos ensayos de proliferación está limitada (véase la Figura 2). Los ensayos de proliferación, como la que hemos utilizado (Figura 2C), reportar una señal que incluye las contribuciones de células apoptóticas y necróticas. Las medidas automáticas de cambio de diámetro no tienen esa limitación, ya que las mediciones se refieren sólo a las células viables. La viabilidad celular se evaluó mediante la exclusión de tinción de azul de tripano de las células sanas, viables. En las mediciones de tamaño, utilizando adelantedispersión de la luz en citometría de flujo de células doblete discriminación puede ser problemático 22. En las mediciones de contador de células automatizado, sin población doblete se encontró (Figura 1). Además, la medición fue suficientemente preciso para distinguir entre los efectos de 100 y 200 nM ciclosporina (Tabla 1) y para detectar la blastogénesis dentro de 12 h de la estimulación mitogénica (Figura 2D).

Este nuevo ensayo es particularmente útil para pequeñas cantidades de muestras. Hasta 15 muestras se pueden medir en 1 hr. Sin embargo, el ensayo tiene sus limitaciones, la mayoría de los cuales pueden ser mitigados. A pesar de que puede resolver con eficacia diferencia pequeña (<1 m) de diámetro celular, el modelo de máquina que usamos tiene un umbral de detección inferior de 5 micras. Este límite puede causar la sobreestimación de tamaños muy pequeños de células, ya que excluye efectivamente todas las células con diámetros más pequeños. Sin embargo, los nuevos modelos de la contador de células tienen umbral de detecciónedad de ~ 2 micras, que debería aliviar este problema. Si hay demasiada escombros en la muestra, el instrumento las trata como células viables. Además, las burbujas de aire de vez en cuando pueden entrar en la celda de flujo y causar distorsiones en las imágenes captadas por las células de la máquina. La distorsión no parece afectar a la determinación de la viabilidad, pero puede afectar a los diámetros medidos. Por lo tanto, se recomienda que todas las imágenes ser revisados ​​por el experimentador haya burbujas de aire antes de aceptar los datos de cada ensayo para el análisis. Puesto que el software sólo se dibuja círculos alrededor de las células, los diámetros de las células no esféricas pueden ser sesgada hacia el eje largo, haciendo que el ensayo de menos adecuados para las células no esféricas.

Este ensayo es rápido, teniendo aproximadamente 4 min por muestra, en comparación con los ensayos de proliferación, que requieren un par de horas. La recolección de datos es también bastante sencilla utilizando el software incluido con el dispositivo. El software puede exportar los datos de medición a un spreadsheet para el análisis. Finalmente, es una sola célula, en lugar de una población, la medición; tanto la blastogénesis y la proliferación se miden; y distingue entre las células viables y muertas al mismo tiempo. Se puede utilizar para evaluar varias cepas de ratón por su capacidad para montar una respuesta inmune. El ensayo también puede ser utilizado con éxito para la medición de la blastogénesis en las células T de donantes humanos (Figura 4), y también puede ser utilizado en otros tipos de células.

Aumenta el volumen celular se sabe que contribuyen a la regulación del metabolismo: hinchazón celular estimula la síntesis de glucógeno inducida por la glutamina y la lipogénesis en los hepatocitos 36,37. Los neutrófilos muestran migración asociada a aumentos de volumen de 35-60%, mientras que los agentes quimiotácticos inducen inflamación 10-15% 38-40. El ensayo actual potencialmente se puede utilizar para estudiar estos procesos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Lucile Wrenshall for the use of the plate reader, Nancy Bigley for useful discussion, and Tom Brown for the gift of ICR mice. This work was funded by grant 1R01AI114804 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and by WSU Faculty Development funds (to J.A.K.). J.N.G. was supported in part by the National Institute of General Medical Sciences grant R25GM090122.

Materials

RPMI-1640  Lonza BW12-702F
40 μm nylon cell strainers  Thermo Fisher Scientific 22363547
nylon wool fiber columns Polysciences, Inc.  21759-1
50 ml conical tubes  The Lab Depot TLD431697
6-well cell culture treated plates USA Scientific CC7682-7506
96-well cell culture treated plates Thermo Fisher Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay  Promega G3582 MTS based assay
Cyclosporine A Sigma-Aldrich 30024
FK506 Cayman Chemical Company 104987-11-3
Rapamycin Santa Cruz Biotechnology sc-3504
TRAM-34 Sigma-Aldrich T6700
FTY720 Sigma-Aldrich SML0700
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 Gibco 11456D
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Acros Organics  356150010
Ionomycin calcium salt Sigma-Aldrich I0634
Penicillin-Streptomycin MP Biomedicals  ICN1670049 100 x stock
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)  HyClone SH30378.02 10 x stock
1,4-dithiothreitol (DTT)  Research Products International 12/3/3483 reducing agent
8 µm micro particle size standard  Sigma-Aldrich 84192-5ML-F Actual  8.02 µm
6 µm micro particle size standard  Sigma-Aldrich 89756-5ML-F Actual 6.084 µm
Single magnetic separation stand for 1.5 – 2 mL tube V&P Scientific, Inc. VP772F5
Cell culture incubator Forma Scientific  3110
Synergy H1 hybrid reader  Bio Tek BTH1M
Vi-CELL cell viability analyzer  Beckman Coulter 731050
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weiss, A., Samelson, L. E., Paul, W. E. T-lymphocyte activation. Fundamental Immunology. , 321-364 (2003).
  2. Gergely, P., Ernberg, I., Klein, G., Steinitz, M. Blastogenic response of purified human T-lymphocyte populations to Epstein-Barr virus (EBV). Clin Exp Immunol. 30 (3), 347-353 (1977).
  3. Sanderson, R. J., Rulon, K., Groeneboer, E. G., Talmage, D. W. The response of murine splenic lymphocytes to concanavalin A and to co-stimulator. J Immunol. 124 (1), 207-214 (1980).
  4. Decoursey, T. E., Chandy, K. G., Gupta, S., Cahalan, M. D. Mitogen induction of ion channels in murine T lymphocytes. J Gen Physiol. 89 (3), 405-420 (1987).
  5. Nibbering, P. H., Zomerdijk, T. P., Tilburg, A. J., Furth, R. V. Mean cell volume of human blood leucocytes and resident and activated murine macrophages. J Immunol Methods. 129 (1), 143-145 (1990).
  6. Segel, G. B., Cokelet, G. R., Lichtman, M. A. The measurement of lymphocyte volume: importance of reference particle deformability and counting solution tonicity. Blood. 57 (5), 894-899 (1981).
  7. Cooper, H. L., Braverman, R. Protein synthesis in resting and growth-stimulated human peripheral lymphocytes. Evidence for regulation by a non-messenger RNA. Exp Cell Res. 127 (2), 351-359 (1980).
  8. Cooper, H. L., Braverman, R. Close correlation between initiator methionyl-tRNA level and rate of protein synthesis during human lymphocyte growth cycle. J Biol Chem. 256 (14), 7461-7467 (1981).
  9. Teague, T. K., et al. Activation changes the spectrum but not the diversity of genes expressed by T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12691-12696 (1999).
  10. Tzur, A., Kafri, R., Lebleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell growth and size homeostasis in proliferating animal cells. Science. 325 (5937), 167-171 (2009).
  11. Messele, T., et al. Nonradioactive techniques for measurement of in vitro T-cell proliferation: alternatives to the [3H]thymidine incorporation assay. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (4), 687-692 (2000).
  12. Maghni, K., Nicolescu, O. M., Martin, J. G. Suitability of cell metabolic colorimetric assays for assessment of CD4+ T cell proliferation: comparison to 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) ELISA. J Immunol Methods. 223 (2), 185-194 (1999).
  13. Weichert, H., Blechschmidt, I., Schröder, S., Ambrosius, H. The MTT-assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing: application to human peripheral blood lymphocytes (PBL). Allerg Immunol (Leipz). 37 (3-4), 139-144 (1991).
  14. Huang, K. T., Chen, Y. H., Walker, A. M. Inaccuracies in MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids. Biotechniques. 37 (3), 410-412 (2004).
  15. Rampersad, S. N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors (Basel). 12 (9), 12347-12360 (2012).
  16. Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
  17. Augustine, N. H., Pasi, B. M., Hill, H. R. Comparison of ATP production in whole blood and lymphocyte proliferation in response to phytohemagglutinin. J Clin Lab Anal. 21 (5), 265-270 (2007).
  18. Sottong, P. R., Rosebrock, J. A., Britz, J. A., Kramer, T. R. Measurement of T-lymphocyte responses in whole-blood cultures using newly synthesized DNA and ATP. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (2), 307-311 (2000).
  19. Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell tracking 2007: a proliferation of probes and applications. Immunol Invest. 36 (5-6), 527-561 (2007).
  20. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  21. Teague, T. K., Munn, L., Zygourakis, K., Mcintyre, B. W. Analysis of lymphocyte activation and proliferation by video microscopy and digital imaging. Cytometry. 14 (7), 772-782 (1993).
  22. Böhmer, R. M., Bandala-Sanchez, E., Harrison, L. C. Forward light scatter is a simple measure of T-cell activation and proliferation but is not universally suited for doublet discrimination. Cytometry A. 79 (8), 646-652 (2011).
  23. Lee, J., Sadelain, M., Brentjens, R. Retroviral transduction of murine primary T lymphocytes. Methods Mol Biol. 506, 83-96 (2009).
  24. Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J Immunol Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
  25. Trickett, A., Kwan, Y. L. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 275 (1-2), 251-255 (2003).
  26. Pène, J., Rahmoun, M., Temmerman, S., Yssel, H. Use of anti-CD3/CD28 mAb coupled magnetic beads permitting subsequent phenotypic analysis of activated human T cells by indirect immunofluorescence. J Immunol Methods. 283 (1-2), 59-66 (2003).
  27. Sigal, N. H., Dumont, F. J. Cyclosporin A, FK-506, and rapamycin: pharmacologic probes of lymphocyte signal transduction. Annu Rev Immunol. 10 (1), 519-560 (1992).
  28. Fruman, D. A., Klee, C. B., Bierer, B. E., Burakoff, S. J. Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (9), 3686-3690 (1992).
  29. Pollizzi, K. N., Waickman, A. T., Patel, C. H., Sun, I. H., Powell, J. D. Cellular size as a means of tracking mTOR activity and cell fate of CD4+ T Cells upon antigen recognition. PLoS One. 10 (4), e0121710 (2015).
  30. Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Regulation of T cells by mTOR: the known knowns and the known unknowns. Trends Immunol. 36 (1), 13-20 (2015).
  31. Mandala, S., et al. Alteration of lymphocyte trafficking by sphingosine-1-phosphate receptor agonists. Science. 296 (5566), 346-349 (2002).
  32. Qin, X., et al. Sphingosine and FTY720 are potent inhibitors of the transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) channels. Br J Pharmacol. 168 (6), 1294-1312 (2013).
  33. Wulff, H., Kolski-Andreaco, A., Sankaranarayanan, A., Sabatier, J. M., Shakkottai, V. Modulators of small- and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels and their therapeutic indications. Curr Med Chem. 14 (13), 1437-1457 (2007).
  34. Petho, Z., et al. The anti-proliferative effect of cation channel blockers in T lymphocytes depends on the strength of mitogenic stimulation. Immunol Lett. 171, 60-69 (2016).
  35. Wulff, H., et al. Design of a potent and selective inhibitor of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, IKCa1: a potential immunosuppressant. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (14), 8151-8156 (2000).
  36. Lang, F., et al. Functional significance of cell volume regulatory mechanisms. Physiol Rev. 78 (1), 247-306 (1998).
  37. Hue, L. Control of liver carbohydrate and fatty acid metabolism by cell volume. Biochem Soc Trans. 22 (2), 505-508 (1994).
  38. O’Flaherty, J. T., Kreutzer, D. L., Ward, P. A. Neutrophil aggregation and swelling induced by chemotactic agents. J Immunol. 119 (1), 232-239 (1977).
  39. Hsu, L. S., Becker, E. L. Volume changes induced in rabbit polymorphonuclear leukocytes by chemotactic factor and cytochalasin B. Am J Pathol. 81 (1), 1-14 (1975).
  40. Rosengren, S., Henson, P. M., Worthen, G. S. Migration-associated volume changes in neutrophils facilitate the migratory process in vitro. Am J Physiol. 267, C1623-C1632 (1994).

Tags

T LymphocyteBlastogenesisBlast TransformationImmunomodulatory DrugsAutomated Cell CounterCell DiameterT Lymphocyte ActivationT Lymphocyte ProliferationSpleenSplenocyteNylon Wool ColumnRed Blood Cell LysisRPMI Medium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gibson, J. N., Beesetty, P., Sulentic, C., Kozak, J. A. Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs. J. Vis. Exp. (118), e55212, doi:10.3791/55212 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image