T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.
התפשטות לימפוציטים בתגובה אנטיגני או גירוי mitogenic היא תופעה לכימות בקלות שימושי המערכת החיסונית בדיקות (כלומר, אימונוסופרסיבי או immunostimulatory) תרכובות כימיות התרופות הביולוגיות. אחד הצעדים המוקדמים במהלך mitogenesis הוא הגדלת תא או שינוי blastogenic, ואז עולה נפח תא לפני החלוקה. זה בדרך כלל לגילוי בשעות המספר הראשונה של גירוי T-לימפוציטים. כאן אנו מתארים שיטה מהירה לכמת blastogenesis בלימפוציטים T המבודדים טחול עכבר ותאי הדם היקפיים mononuclear אדם (PBMCs) באמצעות דלפק תא אוטומטי. מבחני התפשטות שונים הנפוץ על פי רוב הם מייגע ורק לשקף את השפעת האוכלוסייה הכללית ולא תופעות הסלולר הפרט בתוך אוכלוסיה. לעומת זאת, assay נגד תא האוטומטי הציגה מספקת מדידות מהירות, ישירות, ומדויקות של קטרי תא שיכול להיותהמשמש להערכה האפקטיבית של mitogens השונה ותרופות אימונו במבחנה.
לימפוציטים מסוג T הם תאים ראשוניים אחראי חסינות אדפטיבית ביונקים. זה ידוע כי הם מגיבים פפטידים ספציפיים אנטיגני שהציגו מולקולות MHC על פני השטח של תאי מציגי אנטיגן. עם הפעלת קולטן T-cell מאותו מקור (TCR), התא מגדיל ב תהליך שמכונה טרנספורמציה blastogenic, או blastogenesis. תהליך זה ניתן לגלות כבר בתוך השעה הראשונה ~ 6 לאחר הגירוי מוחל 1. במהלך blastogenesis, היקפי תאי T פרט להגדיל 2 עד פי 4 2-6. לימפוציטים מתחילים להתרבות בתהליך הנקרא שיבוטים, שמטרתו היא ליצור שיבוטים כמה שיותר תאי TCR נושאות אנטיגן ספציפי ככל האפשר. התאים הצאצאים ואז להפעיל פונקציה אימונולוגית שלהם תוך הבחנה לתוך ציטוטוקסיות (CD8 +) או עוזר לימפוציטים מסוג T מפעיל (CD4 +). לפיכך, לימפוציטים מסוג T נאיבי בדם אנושי או עכבר נמצא בשלב G 0 (מנוחה) של התאמחזור ופעילות מטבולית תמיכה מינימלית. בחשיפה אנטיגנים או mitogens, תאי T להזין מחדש את מחזור התא, עם גירוי בו זמני של סינתזת שעתוק וחלבוני 7-10. Mitogens, כגון phorbol 12-myristate 13-תצטט (PMA) ו ionomycin לעורר את לימפוציטים דרך ההפעלה של C פרוטאין קינאז (PKC) ו Ca 2 + איתות תלויה מסלולי 1. הפעלת תאי T עם PMA / ionomycin עוקפת את צעדי איתות TCR.
בהתרבות במבחנת מבחנים נמצאים בשימוש נרחב לצורך הערכת תפקוד לימפוציטים בתגובה לגירויים. קריאות הפצה נלקחות בדרך כלל אחד עד שלושה ימים לאחר תחילת גירוי תאי T ומשקפות את המדינה הקולקטיבית של מאה או אלף תאים. עוצמתה של mitogens השונה ותרופות אימונו במבחנה ניתן להעריך פשוט על ידי מדידת שיעורי התפשטות בנוכחות תרכובות אלו. חלק של אלהssays והמגבלות שלהם הם דנו בהמשך.
בדבר ספירת מספר סלולארי ישירה, ההליך הוא גוזל זמן בהסתברות גבוהה של טעויות מפעיל.
עבור סינתזה של DNA, assay ההתאגדות thymidine-3H מודד סינתזה של DNA, אך המגבלה העיקרית שלה היא radiotoxicity שלה. חלופה לא רדיואקטיבי הוא BrdU, אבל בטווח של התגובה ליניארי עבור צמיחת תאים מוגבל, וטיפול נוגדן נדרש, אשר מגדילה את מספר השלבים בהליך 11,12.
עבור פעילות מטבולית, מלחים tetrazolium (MTT, MTS, XTT, ו WST-1) ו resazurin מבחני colorimetric מבוסס הצבע ולדווח על המצב המטבולי הכללי של חלוקת אוכלוסיות תאים. עם זאת, MTT אינו מסיס במדיום התרבות, המחייב שלבים לשטוף נוספים, ובכך שילוב שגיאות במדידה; XTT צריך מרכיבים נוספים כדי להפחית ביעילות; MTS-, WST-1-, ומדידות מבוססי resazurin הם משפיעיםאד על ידי ה- pH בינוני תרבות ואדום 13-16 בסרום, אלבומין או פנול מרכיביו. מבחנים אלה לא מודדים את המספר האמיתי של תאי קיימא אלא לאמידה של פעילויות אנזים בשילוב. לפיכך, שיעור ההתפשטות לא ניתן לקבוע במדויק על ידי מבחני מטבולית בגלל המתאם שאינו ליניארי בין מספר תא לצבוע הפחתת 12,17.
למדידת ריכוז ה- ATP, עליות תאי T-induced ההפעלה ATP לתאם עם התפשטות. עם זאת, העלאת רמת ה- ATP התאי היא אחד הצעדים הראשונים של הפעלת תא T; שלבים רבים מאחורי הוא ההתפשטות בפועל 17,18.
עבור assay דילול צבע, צבע פלואורסצנטי CFSE מכתים תאים באמצעות קשירת קוולנטית חלבונים תאיים. לצבוע מראה ירידה תלוית התפשטות העוצמת פלורסנט, אשר יכול לעקוב אחר מספר חלוקות תא. עם זאת, בשל תיוג חלבון קוולנטיים, התפקידים אלהאפשר להתפשר חלבונים. צבען הוא רעיל לתאים בריכוזים גבוהים. בריכוזים לצבוע נמוכים, לעומת זאת, את עוצמת הקרינה הראשונית מצטמצמת, ומקטינה את מספר חלוקות תא שניתן לעקוב אחריהם. בנוסף, לאחר תיוג עם CFSE, יש אובדן 50% ~ עצמאית-התפשטות קרינה ראשונית במהלך התקופה 24 עד 48 השעות הראשונות, אשר מגבילה את הטווח הדינמי של assay זה 19,20.
רוב המבחנים אלה משקפים את המצב הקולקטיבי של מספר הגדול של תאים ודורשים לטיפול בתאים עם צבעי ניאון. תאי נימקי אפופטוטיים עשויים גם לתרום מדידות אלה, אלא אם כן הם מוסרים מן הניתוח על ידי צביעה עם כימיקלים או נוגדנים.
Blastogenesis לימפוציטים יכול להיות מוערך על ידי מגוון שיטות, כגון מיקרוסקופיה אופטית או cytometry זרימה 4,21,22. כאן אנו מתארים שיטה מהירה למדידת גדלים תאי T באמצעותn אוטומטית דלפק תא, אשר אוסף תמונות תא בזמן אמת מאוחסן וניתן מחדש נתחו במועד מאוחר יותר. בנוסף מדידות גודל, המכשיר הזה מספק מספרים סלולריים מדויקים באחוז תאי קיימא, כפי שנקבע על ידי הרחקת כתם הכחולה trypan. המכשיר בשימוש בפרוטוקול זה זמין מסחרי, ואת היצרנית נבדקת הדיוק של המכשיר באמצעות שלושה כלים שונים ובקרות ריכוז כדאיים כמה. תוצאות המחקרים הללו הפגינו מקדם שונה כי היה בדרך כלל מתחת ל -6%. כפי שצוין בפרוטוקול, המכשיר הוא מכויל על בסיס קבוע עם 6 מיקרומטר ו -8 מיקרומטר בקוטר חרוזי פוליסטירן. היתרונות של שימוש מונה תא להבדיל בין תאי T מנוחת lymphoblasts T מבוססים על קוטר תא הוא קלות שימוש ואת האופי האוטומטי של הניתוח. התוכנה מסוגלת של ציור עיגול סביב כל תא וחישוב קוטר התא. בנוסף, imגילים גלויים למפעיל, אשר יכול לאמת את הדיוק של המכשיר בזיהוי התא ונכון ציור עיגול סביבם. במונחים של מגבלות, המכשיר לא יכול כשלעצמו להבדיל בין פסולת ותאים; ולכן, חשוב כי המפעיל רואה בכל תמונה כפי שהיא מעובדת. קיים פוטנציאל לשילוב בועות אוויר, אשר יקטין את מספר תחומים אפשריים לניתוח; עם זאת, זה נדיר אם החזקת השטיפה הרגילה מבוצעת.
במחקר זה, קבוצות של לימפוציטים מסוג T הטחול היו מגורה עם ionomycin והגדלת ריכוזי PMA עבור 12-48 שעות. ריכוזי PMA נמוכים כמו 2 ng / ml הוא מושרה תגובה blastogenic חזקה ושגשוגם משמעותי. מדידות של תופעות של מספר תרופות, כגון ציקלוספורין A immunosuppressants (CsA), FK506 (tacrolimus), ו rapamycin (sirolimus), כמו גם טראם-34 חוסמי תעלות יונים FTY720 (fingolimod), על blastogenesis הפגין הסכם טוב עם אפקטים דיווחו על התפשטות. תגובת blastogenic של PBMCs אדם PMA / ionomycin ו murine גירוי תאי T עם אנטי CD3 ואנטי-CD28 מצופה נוגדנים חרוזים מגנטיים נמדדה גם.
את assay דלפק התא מכמת הוא blastogenesis ואת קצב ההתפשטות (צפיפות תאים) בו זמנית, אך בנפרד, להבדיל מהשיטות הנ"ל, אשר להסתכל שילוב של השפעות אלו. הפרוטוקול המובא מספק טכניקה מהירה וחזקה על מנת לאמוד את עוצמת סוכני mitogenic ואת המערכת החיסונית.
כאן אנו מתארים טכניקת האיתור וכימות המהיר של טרנספורמציה T-cell blastogenic באמצעות דלפק תא אוטומטי. בתנאים שלנו (250 ng / ml PMA ו -250 ננומטר ionomycin גירוי), באזור תא השטח הוגדל כפולה ושלושה פי נפח לאחר 48 שעות של הפעלה. Assay הוא רגיש מספיק כדי לזהות פיצוץ במהלך ההפעלה 12 שעות של הראשון, כאשר נפח התא גדל רק 1.25 פי לעומת נח (2D איור). מנגנון רלוונטי יותר פיסיולוגי של הפעלת תאי T באמצעות אנטי CD3 ו חרוזים מגנטיים מצופה נוגדן אנטי CD28 היוצר תגובת blastogenic משמעותית, עם גידול פי 2.3 בממוצע בנפח (72 שעות לאחר הפעלה, איור 3D). תאים mononuclear אדם הראה שינוי 2.6 של פי נפח על PMA / ionomycin גירוי במשך 48 שעות (איור 4). הקוטר הממוצע של תאי T טחול עכבר ICR והנפח נקבעו6.9 מיקרומטר ו 1.9 x 10 -4 NL, בהתאמה. PBMCs אדם (מתורם בריא אחד) היה בקוטר ממוצע של 7.7 מיקרומטר ו היקף ממוצע של 2.7 x 10 -4 NL. שימוש בפרוטוקול זה, אנחנו גם נבדק ריכוז גדל והולך של PMA על יכולתם להפעיל תאי T. תוצאות חד-תאיים אלה עלו בקנה אחד עם מבחני התפשטות ביצע בריכוזים PMA דומה.
תרכובות דיווחו מספר להשפיע שגשוג התאים נבדקו: FTY720 31,32; א ציקלוספורין immunosuppressants, FK506, ו Rapamycin 27,28; וחשמלית-34, חוסם ערוצי KCa3.1 המופעל סידן 33,35. מצאנו כי, בריכוזים שנבדקו, המעכבים החזקים ביותר של blastogenesis היו CSA ו FK506. היה Rapamycin השפעה מדכאת קטנה אך משמעותית מבחינה סטטיסטית על blastogenesis. טראם-34, מצד שני, לא השפיע blastogenesis.
CsA דיכא גם blastogenesis ו- proliferation, אבל לא לגמרי (האיור 2B ו 2C), ההוכחה כי מדידה נגד תא אוטומטי הוא לתאם טוב של יעילות תרופה בהתרבות תאי T. בנוכחות rapamycin יחד עם CSA, blastogenesis היה מופנם לחלוטין, דבר המצביע על כך NFAT- ושבילים בתיווך mTOR בשילוב יכול להסביר באופן מלא להגדלת תאי T על גירוי mitogenic עם PMA / ionomycin (איור 3 ג).
הטווח הדינמי של מבחני התפשטות כמה מוגבל (ראה איור 2). מבחני הפצת נשק, כמו זו השתמשנו (איור 2 ג), לדווח אות הכוללת תרומות תאים אפופטוטיים ו נמקי. מדידות שינוי בקוטר אוטומטיות אין מגבלה, כמו המדידות נוגעות תאי קיימא בלבד. כדאיות התא מוערך על ידי הרחקה של כתם כחול trypan מתאי בריא, בר קיימא. במדידות גודל, באמצעות קדימהפיזור אור בתזרים cytometry אפלית תא כפיל יכול להיות בעייתי 22. בשנת המדידות נגד תא האוטומטי, לא אוכלוסיית כפיל נמצאה (איור 1). כמו כן, המדידה הייתה מדויקת מספיק כדי להבחין בין ההשפעות של 100 ו -200 ננומטר ציקלוספורין (טבלת 1), וכדי לזהות blastogenesis בתוך 12 שעות של גירוי mitogenic (איור 2 ד).
assay חדש תכונה זו שימושית במיוחד עבור מספר קטן של דוגמאות. עד 15 דגימות יכולות להימדד 1 hr. עם זאת, assay יש מגבלות, שרובן ניתן למתן. למרות שזה יכול למעשה לפתור קטן (<1 מיקרומטר) ההבדל בקוטר התא, מודל המכונה השתמשנו שסף זיהוי ותחתון של 5 מיקרומטר. מגבלה זו יכולה לגרום יתר של גדלי תאים קטנים מאוד, שכן הוא יעיל כולל את כל תאים עם בקטרים קטנים. עם זאת, הדגמים החדשים של הדלפק תא יש דיש זיהויבנים של ~ 2 מיקרומטר, אשר אמור להקל על בעיה זו. אם יש יותר מדי פסולת במדגם, המכשיר מתייחס אליהם תאי קיימא כמו. בנוסף, בועות אוויר יכולות לקבל מדי פעם לתוך תא הזרימה ולגרום לעיוות של תמונות התא שנתפסו על ידי מכונה. העיוות אינה מופיעה כדי להשפיע על קביעת הכדאיות, אבל זה יכול להשפיע על בקטרים הנמדדים. לכן, מומלץ כי כל התמונות להיבדק על ידי הנסיין בועות אוויר לפני נתוני כל ניסוי מתקבלים לניתוח. מאז התוכנה רק שואבת במעגלים סביב התאים, בקטרים של תאים שאינם כדוריים עשויים להיות מוטים כלפי ציר הזמן, מה שהופך את assay פחות מתאים תאים שאינם כדוריים.
assay זה הוא מהיר, לוקח דקות 4 כ לדגימה, לעומת מבחני התפשטות, אשר דורשים מספר שעות. איסוף נתונים הוא גם די פשוט באמצעות התוכנה מצורפת להתקן. התוכנה יכולה לייצא נתוני מדידה על spreadsheet לניתוח. לבסוף, הוא תא בודד, בניגוד אוכלוסייה, מדידה; הן blastogenesis ושגשוגם נמדדים; והיא מבדילה בין תאי קיימא ומתים בעת ובעונה אחת. ניתן להשתמש בו כדי להעריך זני עכבר שונים על יכולת הר תגובה חיסונית. Assay יכול לשמש גם בהצלחה לשקילה blastogenesis בתאי T מתורמי אדם (איור 4), והוא יכול לשמש גם סוגי תאים אחרים.
נפח עליות ניידות ידועות לתרום בוויסות של חילוף חומרים: נפיחות תא יעודד את סינתזת הגליקוגן נגרמת גלוטמין ו lipogenesis ב hepatocytes 36,37. נויטרופילים להציג עליות נפח הקשורים הגירה של 35-60%, ואילו סוכני chemotactic לגרום 10-15% נפיחות 38-40. את assay הנוכחי יכול לשמש פוטנציאל ללמוד תהליכים אלה.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lucile Wrenshall for the use of the plate reader, Nancy Bigley for useful discussion, and Tom Brown for the gift of ICR mice. This work was funded by grant 1R01AI114804 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and by WSU Faculty Development funds (to J.A.K.). J.N.G. was supported in part by the National Institute of General Medical Sciences grant R25GM090122.
RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100 x stock |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10 x stock |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
Single magnetic separation stand for 1.5 – 2 mL tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |